嗜酸性喜溫硫桿菌谷胱甘肽還原酶基因的生物學(xué)功能研究.pdf

1、浸礦環(huán)境是酸性和高濃度重金屬存在的極端環(huán)境，浸礦細(xì)菌的優(yōu)劣取決于其氧化能力和抗逆性能，其氧化機(jī)制和抗逆機(jī)制是研究的重點(diǎn)。嗜酸性喜溫硫桿菌（Acidithiobacillus caldus，簡稱A.caldus）是一種專性化能自養(yǎng)硫氧化細(xì)菌，以卡爾文循環(huán)固定空氣中的CO2作為碳源，能氧化無機(jī)還原性硫化物獲得生長所必需的能量和還原力，A.caldus在生物冶金、煤的脫硫和含硫廢水的處理等方面發(fā)揮重要作用，是硫氧化浸礦菌，其單質(zhì)硫的活化氧化機(jī)

2、制是有待解決的重要問題。有研究認(rèn)為，單質(zhì)硫活化氧化依賴于還原型谷胱甘肽GSH。谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)能催化氧化型谷胱甘肽與還原型谷胱甘肽兩者間的相互轉(zhuǎn)化，是產(chǎn)生GSH的關(guān)鍵酶，研究該酶的功能對硫活化氧化機(jī)制的闡釋有重要意義。GR還能清除生物體內(nèi)的活性氧，在對抗重金屬、高鹽和氧化劑等逆境方面發(fā)揮重要作用。因此，本文將對A.caldus的GR在硫氧化和抗逆方面的功能進(jìn)行下列研究，對提高其工業(yè)應(yīng)用前

3、景具有重要意義。
　　第一，對A caldus MTH-04中的gr(orf0872)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明gr的序列高度保守，可能位于細(xì)胞質(zhì)中。然后克隆gr并在E.coli中進(jìn)行表達(dá)，對其酶活及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定，研究結(jié)果表明:GR的酶活為415.8U/mg protein，最適pH為7.0，最適溫度30℃，Cu2+、Zn2+、Cd2+、Ag+、Fe2+、Co2+均強(qiáng)烈抑制酶活，而Ca2+、Mg2+、Sn2+、Mn2+對酶活

4、影響不大。
　　第二，利用基于細(xì)菌自身Rec重組系統(tǒng)的"in-out"敲除策略，構(gòu)建gr的無痕敲除株Δgr和相應(yīng)的回補(bǔ)株Δgr（pJRD215-gr），并將gr在A.caldus MTH-04中過表達(dá)獲得含有tac強(qiáng)啟動(dòng)子的過表達(dá)菌株A.c(pJRD215-tac-gr)。
　　第三，通過對Δgr、Δgr（pJRD215-gr）、A.c(pJRD215-tac-gr)及A.c(wild)在S0培養(yǎng)條件下的生長曲線測定以及各菌

5、株在Cu2+、Zn2+金屬離子刺激和鹽刺激條件下生長曲線的測定等表型分析，結(jié)果表明在以S0為能源時(shí)，各菌株生長無明顯差異，但在有Cu2+、Zn2+、Na2SO4刺激時(shí)，隨著刺激濃度的升高，菌株表現(xiàn)出明顯的延遲生長，且對Δgr的抑制作用尤為明顯，甚至致死，而回補(bǔ)株Δgr（pJ RD215-gr）的谷胱甘肽還原酶功能恢復(fù)，其生長情況恢復(fù)到與野生型基本一致，這些結(jié)果都表明gr在抗逆過程中發(fā)揮重要的作用。
　　第四，通過熒光定量RT-PC

6、R分析，比較缺失突變株Δgr、回補(bǔ)株、過表達(dá)菌株及野生株在S0培養(yǎng)以及金屬離子刺激下的硫氧化系統(tǒng)相關(guān)基因、谷胱甘肽代謝相關(guān)基因和氧化壓力應(yīng)答相關(guān)基因在表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn):①以單質(zhì)硫?yàn)槟茉磿r(shí)，gr敲除株中谷胱甘肽還原酶基因不表達(dá)，但是谷胱甘肽合成酶以及參與生成GSH的硫加雙氧酶等基因上調(diào)表達(dá);在過表達(dá)菌株中，gr上調(diào)表達(dá)，此時(shí)，谷胱甘肽合成酶以及受谷胱甘肽合成酶調(diào)節(jié)的谷胱甘肽-硫-轉(zhuǎn)移酶均下調(diào)表達(dá)，通過這些基因的協(xié)同作用，生物體內(nèi)的[G

7、SSG]/[GSH]水平仍能維持在正常水平，因而對菌株的生長無明顯影響。②以單質(zhì)硫?yàn)槟茉矗嬖贑u2+、Zn2+刺激時(shí)，gr敲除株中g(shù)lutathione reductase不表達(dá)，此時(shí)thiol peroxidase，peroxiredoxin，thioredoxin reductase，glutathione peroxidase等抗氧化酶均上調(diào)表達(dá);而在gr過表達(dá)菌株中，glutathione reductase上調(diào)表達(dá)，此時(shí)其他