嗜酸性喜溫硫桿菌基因無(wú)痕敲除方法的建立及soxYZ敲除株的性狀分析.pdf

1、嗜酸性喜溫硫桿菌(Acidithiobacillus caldus,簡(jiǎn)稱A. caldus)為革蘭氏陰性菌,是一種專性自養(yǎng)硫氧化細(xì)菌,最適pH為1.5-2.5,最適溫度為40-50℃,能氧化無(wú)機(jī)還原性硫化合物獲得生長(zhǎng)所必需的能量和還原力,以卡爾文循環(huán)固定空氣中的CO2作為碳源。A. caldus在生物冶金、煤的脫硫和含硫廢水的處理等方面發(fā)揮重要作用。但是,A. caldus生長(zhǎng)緩慢,代時(shí)長(zhǎng),細(xì)胞得率低,影響其浸礦效率,因此,對(duì)A.cal

2、dus的生長(zhǎng)代謝進(jìn)行深入研究以及利用分子生物學(xué)手段改造A.caldus,是該領(lǐng)域當(dāng)前的重要課題。由于自養(yǎng)微生物生長(zhǎng)緩慢和遺傳操作困難,目前國(guó)際上對(duì)A.caldus遺傳操作體系的研究比較緩慢,雖然已經(jīng)建立了成熟的基因轉(zhuǎn)移方法,但較為復(fù)雜,并且基因無(wú)痕敲除方法尚無(wú)報(bào)道。A. caldus的基因組測(cè)序已經(jīng)完成,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)A.caldus中與硫代謝相關(guān)的基因包括兩處不完整的Sox硫氧化基因簇soxX-soxY-soxZ-soxA-hyp

3、-soxB (sox clusterⅠ)和soxY-soxZ-soxB-hyp-resB-soxX-soxA-resC (sox clusterⅡ),以及非Sox硫氧化基因sqr, doxD, tth, hdr, sor等,也包括末端氧化酶和NADH醌氧化還原酶。各個(gè)硫氧化基因的功能是什么,以及如何在A.caldus中協(xié)調(diào)作用、共同氧化無(wú)機(jī)硫化合物,仍然在探索中。本論文首先在A. caldus中建立了基于細(xì)菌自身Rec同源重組和利用I-

4、SceⅠ大范圍核酸內(nèi)切酶的"in-out"基因無(wú)痕敲除方法,構(gòu)建了自殺型質(zhì)粒載體pSDUDⅠ和I-SceⅠ酶的表達(dá)質(zhì)粒pSDU1-I-SceⅠ,并成功敲除Sox clusterⅡ中硫氧化代謝基因soxYZ(ORF2520-2521),篩選效率為7%,在國(guó)際上首次成功建立了A.caldus基因無(wú)痕敲除方法,為深入研究A.caldus基因功能和分子生物學(xué)改造A.caldus奠定了基礎(chǔ)。然后測(cè)定了A. caldus野生株和soxYZ(ORF2