流感H5N1-H9N2型二價病毒樣顆粒疫苗的研制.pdf

1、近年來，由禽流感病毒引起的流感疫情在全球各地大規(guī)模爆發(fā)。高致病性禽流感不僅能使禽類大批量死亡，而且還能感染人類引發(fā)嚴重的呼吸道疾病。低致病性禽流感會引起家禽患病、產蛋量下降甚至死亡。因此爆發(fā)禽流感疫情將導致嚴重的經濟損失，嚴重威脅人類生命健康。隨著我國家禽養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，H9N2型禽流感爆發(fā)將帶來嚴重的經濟損失。H5N1型禽流感病毒致病能力強，能使人類和家禽均患病且死亡率高，已然成為全球公共衛(wèi)生關注的焦點。目前，我國防

2、治禽流感疫情主要依靠疫苗免疫接種。市場上銷售的禽流感疫苗主要以滅活疫苗為主，但該疫苗存在返毒風險及滅活劑等缺點，無法應對禽流感疫情的爆發(fā)。因此研制出高效安全的流感疫苗越來越受到關注。由于VLP不含有病毒核酸，無致病性，且其表面具有抗原成分，是新型疫苗研究的熱點。目前，我國尚未出現(xiàn)用于預防H5N1、H9N2型禽流感的VLP疫苗。基于以上問題，本課題將研制出三種不同佐劑類型的流感H5N1/H9N2型二價VLP疫苗，并從免疫方面驗證二價VLP

3、疫苗的免疫效果。
　　目的：本研究利用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備H5N1 VLP和H9N2 VLP，以脂質體、白油及殼聚糖微球為佐劑，研制出三種不同佐劑的二價VLP疫苗。對VLP疫苗進行動物免疫效果評價，篩選出免疫原性強、安全及長效的流感H5N1/H9N2型二價VLP疫苗。
　　方法：通過對H5N1和H9N2重組桿狀病毒P1代進行增殖及TCID50測定，Western Blot檢測VLP中HA、M1蛋白的特異性，并用ELISA和血

4、球凝集實驗分別測定VLP中HA含量及其血凝效價。其次采用薄膜凍融法制備脂質體，通過單因素和正交實驗篩選出脂質體制備的最佳工藝，研制出二價脂質體VLP疫苗，并對脂質體的包封率、物理穩(wěn)定性、剩余水分和安全性等檢驗。擬用白油及微球佐劑制備出二價VLP油乳佐劑疫苗、二價微球VLP疫苗，并對二價VLP疫苗進行相關質量安全評價及安全試驗。最后通過動物免疫實驗檢測二價VLP疫苗特異性抗體水平。
　　結果：
　　1.通過Western Bl

5、ot鑒定、HA定量ELISA及血球凝集實驗檢測兩種VLP。結果表明，H5N1和H9N2 VLP均出現(xiàn)特異性條帶，HA含量分別為134.42±4.78μg/mL、129.73±4.20μg/mL。具有較高的免疫原性，可作為二價VLP疫苗的原料。
　　2.制備的二價VLP疫苗脂質體的包封率為83.37％，真空烘干法測得的脂質體凍干粉剩余水分為2.5%，4℃低溫保存120天后其包封率達60.78%。油乳佐劑疫苗的穩(wěn)定性常數(shù)為95.5%，

6、二價微球VLP疫苗的體外釋放度達83.1%。
　　3.免疫SPF雞28d后，脂質體組抗H5N1抗體及抗H9N2抗體的HI滴度分別為9.28Log2、9.43Log2，均顯著高于油乳和微球實驗組的抗體滴度（p＜0.01）；除脂質體組外，其它各實驗組中和H5N1、H9N2病毒的抗體滴度均顯著低于滅活疫苗組（p＜0.01），而脂質體組中和H5N1、H9N2病毒的中和價分別為1/97、1/103，顯著高于油乳及微球實驗組（p＜0.01）；

7、T淋巴細胞增殖實驗結果表明，免疫28d后脂質體組的SI指數(shù)與滅活疫苗組無顯著差異，且顯著高于微球及油乳實驗組（p＜0.01），免疫56d后脂質體組的SI指數(shù)均高于微球及油乳實驗組（p＜0.01），H5N1病毒、H9N2病毒刺激脂質體組 T淋巴細胞增殖的SI指數(shù)分別為4.29、5.65，能引起有效的細胞免疫應答。
　　結論：本課題初步研制的二價脂質體VLP疫苗，免疫動物后能誘導產生較好的體液及細胞免疫應答，能為VLP疫苗的研制提供一