人膠質瘤細胞的干細胞特性及誘導分化研究.pdf

1、目的：
　　通過對人膠質瘤細胞株U251的干細胞特性和多向分化潛能的相關研究，揭示膠質瘤細胞的細胞生物學特性；進一步研究膠質瘤細胞向脂肪細胞及成骨細胞分化的條件及可能的機制；進一步展望誘導分化方法作為一種新穎的腦膠質瘤治療方法的臨床應用前景。
　　方法：
　　常規(guī)傳代培養(yǎng)膠質瘤細胞株U251,并將U251細胞傳代培養(yǎng)于24孔細胞培養(yǎng)板中，恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞貼壁后，用4％多聚甲醛固定U251細胞，并檢測U2

2、51中干細胞標志物Sall4、NCAM、Oct4、Sox2、Nestin、和S100β表達情況，熒光顯微鏡下觀察U251細胞上述標志物的表達情況。將貼壁生長的U251細胞分別經(jīng)成脂肪細胞誘導培養(yǎng)基(含有2μmol/L胰島素、500μmol/L（IBMX）、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛)和成骨細胞誘導培養(yǎng)基（含有100mmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉及0.05mmol/L維生素C）誘導分化后，分別

3、用油紅O染色方法檢測細胞中脂滴形成情況，茜素紅染色檢測細胞中鈣結節(jié)形成情況。CCK8法檢測經(jīng)誘導分化后U251細胞生長曲線。免疫蛋白印跡法分別測定脂肪細胞和成骨特異性蛋白表達以及誘導分化過程中細胞自噬和凋亡蛋白表達情況。
　　結果：
　　1.多種干細胞標志物均在人膠質瘤細胞株U251中穩(wěn)定表達。免疫熒光結果顯示在U251中神經(jīng)細胞黏附分子NCAM、神經(jīng)嵴干細胞標記物Nestin、神經(jīng)膠質細胞標記物S100β，多能干細胞標記物

4、Sall4、Oct4及神經(jīng)干細胞的標記物Sox2均能夠穩(wěn)定表達。
　　2.U251細胞經(jīng)誘導后可以向脂肪細胞分化。在貼壁生長的膠質瘤細胞中加入成脂細胞誘導分化培養(yǎng)基后，經(jīng)過誘導不同的時間梯度，油紅O染色發(fā)現(xiàn)膠質瘤細胞中出現(xiàn)脂滴，并且隨著誘導的時間越長，脂滴數(shù)量增多并融合增大，且細胞增殖速度減慢，這點由CCK8實驗結果得以證實。通過免疫蛋白印跡實驗結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導培養(yǎng)基誘導后的膠質瘤細胞中脂肪細胞相關特異性蛋白表達增加。
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5、.U251細胞經(jīng)誘導可以向成骨細胞分化。在貼壁生長的膠質瘤細胞中加入成骨細胞誘導分化培養(yǎng)基后，經(jīng)過誘導不同的時間梯度，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)膠質瘤細胞中出現(xiàn)大量鈣結節(jié)，并且隨著誘導時間的延長，鈣結節(jié)增多。CCK8實驗結果顯示經(jīng)誘導分化后腫瘤細胞增殖減慢；免疫蛋白印跡實驗結果顯示成骨細胞相關特異性蛋白表達增多，并且隨著誘導時間的延長細胞凋亡、自噬及增殖相關蛋白表達也增加。
　　結論：
　　1.人膠質瘤細胞U251具有干細胞特性和多向誘