丹參多酚酸改善APPswe-PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年人群中最常見的一種慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為記憶力下降、計(jì)算力下降、定向力障礙、語言障礙、理解力判斷力下降、情感與行為障礙等，并且這些癥狀嚴(yán)重影響患者及家屬的日常生活。AD大多為散發(fā)形式，也可表現(xiàn)家族性AD，而家族性AD多呈常染色體顯性遺傳。目前已確定的家族性AD突變基因有早老素1（Presenilin1, PS1）基因、早老素2（Presenili

2、n2, PS2）基因、淀粉樣前體蛋白基因（Amyloid precursor protein， APP）以及載脂蛋白E4（Apolipoprotein E4，ApoE4）等位基因。
　　AD的主要病理學(xué)改變有神經(jīng)炎性斑塊、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元減少、神經(jīng)元間的突觸丟失、細(xì)胞顆粒空泡變性和淀粉樣蛋白腦血管變化等。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制，有很多種學(xué)說，目前比較公認(rèn)的為“Aβ級(jí)聯(lián)反應(yīng)學(xué)說”， Aβ的異常沉積可導(dǎo)致線粒體損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)激活、進(jìn)

3、一步促進(jìn)了Tau蛋白的過度磷酸化，最終誘發(fā)細(xì)胞調(diào)亡。APP經(jīng)β和γ分泌酶剪切可以形成Aβ，Aβ分為可溶性片段及不可溶片段，其中不可溶片段可造成細(xì)胞損傷。PS1、PS2及APP等基因的突變可使不可溶性片段增多，觸發(fā)Aβ級(jí)聯(lián)反應(yīng)。另外，AD的發(fā)病機(jī)制還表現(xiàn)為免疫功能異常，主要為小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活和腦內(nèi)某些腦區(qū)炎性細(xì)胞因子水平的過度增高?；罨蟮男∧z質(zhì)細(xì)胞具有抗原呈遞和吞噬功能，可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)引起神經(jīng)元損傷。
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4、96年研制出了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，含有嵌合的小鼠/人類家族性AD基因APP和PS1。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型可模擬人類阿爾茨海默病神經(jīng)組織內(nèi)Aβ斑塊的形成和小膠質(zhì)細(xì)胞增多的現(xiàn)象，對(duì)于理解疾病的病因和驗(yàn)證新的治療方法的療效尤其重要。代謝組學(xué)在阿爾茨海默病的診斷中同樣起到了重要作用，例如在AD患者和轉(zhuǎn)基因AD的動(dòng)物模型的大腦內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了明顯的糖代謝下降，且發(fā)生于典型病理變化出現(xiàn)之前。雖然目前有許多AD的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，但

5、雙轉(zhuǎn)基因APP/PS1小鼠的氧化應(yīng)激損傷相對(duì)較嚴(yán)重。因此，利用此動(dòng)物模型可以評(píng)價(jià)抗氧化藥物的療效。
　　丹參多酚酸(TSA)注射液是從丹參這種傳統(tǒng)中藥中提取的有效成分的水溶性多酚化合物。既往的研究證明，丹酚酸主要的作用是清除多種自由基，具有確切的抗氧化作用。本課題應(yīng)用APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠，進(jìn)行了丹參多酚酸持續(xù)14周的腹腔注射，研究其對(duì)學(xué)習(xí)和記憶力的影響，并進(jìn)一步從代謝組學(xué)、病理變化、小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)等角度探討了該藥物的作

6、用機(jī)制。
　　第一部分：丹參多酚酸改善APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)和記憶的行為學(xué)研究
　　目的：通過動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察丹參多酚酸是否改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　方法：
　　1、將30只雄性APP/PS1小鼠隨機(jī)分為APP/PS1模型組（0.4ml/d生理鹽水腹腔注射），低劑量丹參多酚酸治療組（0.4ml30 mg/kg·d丹參多酚酸注射液腹腔注射），高劑量丹參多酚酸治療組（

7、0.4ml60 mg/kg·d丹參多酚酸注射液腹腔注射），同窩10只雄性APP-／PS1-的野生型小鼠（WT）作為正常對(duì)照組(0.4ml/d生理鹽水腹腔注射)。
　　2、四組小鼠均從3.5月齡開始給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥14周,實(shí)驗(yàn)期間每周測(cè)試一次小鼠體重，根據(jù)小鼠體重調(diào)整每周用藥劑量。
　　3、給藥14周后進(jìn)行新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及避暗實(shí)驗(yàn)。記錄新異物體偏愛指數(shù)、定位航行實(shí)驗(yàn)平均尋臺(tái)潛伏期，探索實(shí)驗(yàn)

8、的穿越原平臺(tái)頻次及穿越原平臺(tái)象限時(shí)間百分比，避暗逃避潛伏期等，評(píng)估各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠均不實(shí)施任何形式的干預(yù)。
　　結(jié)果：
　　1、新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期后1h時(shí)，與正常對(duì)照組相比較APP/PS1模型組小鼠對(duì)新異物體的偏愛指數(shù)明顯下降（P<0.01）。與模型組比較，丹參多酚酸治療后可提高APP/PS1小鼠對(duì)新異物體的偏愛指數(shù)（30mg/kg TSA, P<0.01;60mg/kg TSA, P<

9、0.05）。訓(xùn)練期后24h實(shí)驗(yàn)各組小鼠對(duì)新異物體的偏愛指數(shù)之間無明顯差異[F(3,40)=0.611, P=0.612]。
　　2、 Morris水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)前3天，四組的平均逃避潛伏期無明顯差異（P>0.05）。定位航行實(shí)驗(yàn)的第4、5天，APP/PS1模型組平均逃避潛伏期均明顯增加（P<0.01）。與APP/PS1模型組比較，定位航行的第4、5天兩種劑量的丹參多酚酸組小鼠平均尋臺(tái)潛伏期均明顯縮短[（Day4:30 mg/

10、kg TSA，P<0.01；60 mg/kg TSA，P<0.05）;（Day5:30 mg/kg TSA，P<0.01；60 mg/kg TSA，P<0.01）],同時(shí)尋找站臺(tái)策略均有改善。
　　Morris水迷宮的空間探索實(shí)驗(yàn)中，與正常組相比較，APP/PS1模型組小鼠尋覓原站臺(tái)位置潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.01）。丹參多酚酸的干預(yù)不僅顯著縮短了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠尋覓原站臺(tái)的時(shí)間（P<0.01），而且與正常組相比無明顯差

11、異（P>0.05）。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠穿越原站臺(tái)位置頻次低于正常對(duì)照組（P<0.05）。丹參多酚酸的治療提高了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠穿越原站臺(tái)位置的頻次（30 mg/kg TSA，P<0.01；60 mg/kg TSA，P<0.05）。與正常對(duì)照組相比較，APP/PS1模型組小鼠通過靶向限的時(shí)間百分比縮短（P<0.01）。丹參多酚酸的治療提高了APP/PS1小鼠通過靶向限的時(shí)間百分比（30 mg/kg TSA， P<0.05

12、；60 mg/kg TSA， P<0.01）。
　　3、避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠的逃避潛伏期較正常對(duì)照組明顯縮短（P<0.01）。丹參多酚酸的治療提高了APP/PS1小鼠受電擊后24h的逃避潛伏期（30 mg/kg TSA，P<0.01;60 mg/kg TSA，P<0.05）。
　　第二部分：丹參多酚酸調(diào)節(jié)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠血漿及海馬組織的代謝物質(zhì)
　　目的：觀察經(jīng)丹參多酚酸治療后7月

13、齡APPswe/PS1dE9(APP/PS1)小鼠血漿和海馬組織代謝組學(xué)的變化。
　　方法：
　　1、通過改良葡萄糖過氧化氫酶（Mut.Q-GDH）法快速檢測(cè)小鼠全血的葡萄糖含量。采用膽固醇氧化酶-過氧化物酶（CHO-POD）法檢測(cè)血漿中總膽固醇的含量；運(yùn)用磷酸甘油酯氧化酶-過氧化物酶（GPO-POD）法檢測(cè)血漿中甘油三酯的水平；利用直接法檢測(cè)血漿中高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的濃度。
　　2、用酶聯(lián)免疫吸附

14、試驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠海馬組織Aβ40和Aβ42的水平。
　　3、采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析方法(GC-TOF-MS)檢測(cè)各組小鼠海馬組織代謝物質(zhì)。
　　結(jié)果：
　　1、與正常對(duì)照組相比較， APP/PS1模型組小鼠海馬組織Aβ40和Aβ42明顯升高（P<0.01）。丹參多酚酸的治療顯著降低了APP/PS1小鼠Aβ40和 Aβ42的含量（P<0.01）。兩種劑量的丹參多酚酸給藥組之間， Aβ40和 Aβ42的水平無明顯差

15、異（P>0.05）。另外，與正常組相比較， APP/PS1模型組小鼠海馬Aβ42和Aβ40的比值升高（P<0.05），然而與APP/PS1模型組相比較，丹參多酚酸的治療對(duì)APP/PS1小鼠海馬組織Aβ42和Aβ40的比值無顯著影響（P>0.05）。
　　2、四個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間，小鼠全血葡萄糖和血漿甘油三酯的濃度在組間無明顯差異（P>0.05）。高劑量丹參多酚酸的治療降低APP/PS1小鼠血漿總膽固醇水平（P<0.05）。與正常對(duì)照組相

16、比，APP/PS1模型組血漿低密度脂蛋白膽固醇水平增加（P<0.05）。丹參多酚酸的治療顯著降低了APP/PS1小鼠血漿中低密度脂蛋白膽固醇的含量（P<0.01）。
　　APP/PS1小鼠血漿低密度脂蛋白膽固醇的水平與海馬組織Aβ42水平呈正相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)（r）為0.875；血漿低密度脂蛋白膽固醇水平與海馬Aβ40水平呈正相關(guān)（P<0.01），兩者相關(guān)系數(shù)（r）為0.728。
　　3、四組小鼠海馬組織共檢測(cè)到

17、357個(gè)色譜峰。經(jīng)降噪處理后，海馬內(nèi)共有55個(gè)代謝產(chǎn)物被檢出。經(jīng)過丹參多酚酸的治療，APP/PS1小鼠海馬組織代謝產(chǎn)物的變化主要涉及兩類代謝路徑，碳水化合物代謝包括山梨糖醇，葡萄糖-6-磷酸，蔗糖-6-磷酸，半乳糖等物質(zhì)，維生素代謝包括維生素D3和抗壞血酸。
　　第三部分：丹參多酚酸改善APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織的病理性損傷
　　目的：研究經(jīng)丹參多酚酸治療后，APP/PS1小鼠海馬組織淀粉樣蛋白的表達(dá)，活

18、化小膠質(zhì)細(xì)胞的密度和與記憶相關(guān)的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　方法：
　　1、采用HE染色和尼氏(Nissl)染色進(jìn)行各組小鼠海馬的病理變化及神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量的分析。
　　2、通過熒光剛果紅染色和Aβ免疫組織化學(xué)染色兩種方法檢測(cè)淀粉樣斑塊面積，并計(jì)算各組小鼠海馬內(nèi)淀粉樣斑塊的面積比。
　　3、運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠海馬部位離子鈣接頭蛋白1（Iba1）陽性細(xì)胞，分析單位面積內(nèi)Iba

19、1陽性細(xì)胞的數(shù)量。
　　4、通過透射電鏡觀察各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果：
　　1、丹參多酚酸的治療逆轉(zhuǎn)了APP/PS1小鼠海馬組織內(nèi)的空泡樣變。
　　2、四個(gè)實(shí)驗(yàn)組海馬CA1區(qū)每高倍視野神經(jīng)元數(shù)量之間無明顯差異（P>0.05）。
　　3、丹參多酚酸治療14W后，APP/PS1小鼠海馬組織熒光剛果紅陽性淀粉樣斑塊面積比與相同層面模型組小鼠相比較，第一、二、五層均明顯

20、下降（P<0.01），第三、四層也有所降低（P<0.05）。
　　4、經(jīng)30 mg/kg及60 mg/kg丹參多酚酸治療后，Aβ陽性淀粉樣斑塊面積比與相同層面APP/PS1小鼠斑塊面積比相比較，第一、二和五層明顯下降（P<0.01），第三、四層也略有降低[（Layer3:60 mg/kg TSA, P<0.05）；（Layer4:30 mg/kg TSA, P<0.05；60 mg/kg TSA, P<0.01）]。
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21、、 APP/PS1模型組小鼠海馬單位面積內(nèi)Iba-1陽性細(xì)胞與正常對(duì)照組相比較顯著增多（P<0.01）。經(jīng)丹參多酚酸治療后，海馬單位面積內(nèi)Iba-1陽性細(xì)胞明顯下降（P<0.01），并且與正常對(duì)照組相比無明顯差異（P>0.05）。
　　6、經(jīng)丹參多酚酸的治療，APP/PS1小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改善。
　　結(jié)論：
　　丹參多酚酸的治療可通過保護(hù)APP/PS1小鼠海馬的組織結(jié)構(gòu)，降低A