跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)APP-PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、前言：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病。早期主要的臨床表現(xiàn)為漸進(jìn)性學(xué)習(xí)和記憶能力減退。目前病因尚不明確,普遍認(rèn)為是一種與遺傳、環(huán)境等多因素相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。目前尚無特效的治療藥物和手段。
　　 運(yùn)動(dòng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效的刺激形式,運(yùn)動(dòng)對(duì)大腦的功能重組和代償起著重要作用。眾多研究表明,運(yùn)動(dòng)不僅能夠提高普通人群的認(rèn)知能力,還能減緩AD的發(fā)病和進(jìn)展。盡管體力活動(dòng)對(duì)AD治療的潛在

2、作用被廣泛接受,但是有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)AD作用的機(jī)制研究尚不多見。
　　 海馬長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)是研究學(xué)習(xí)和記憶的理想模型,也是研究AD認(rèn)知損害相關(guān)機(jī)制的生物模型。研究證明,不同類型的AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型均出現(xiàn)海馬LTP減弱,并且AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬環(huán)路的突觸傳遞異常早于Aβ沉積和神經(jīng)細(xì)胞變性。因此,增強(qiáng)海馬LTP的誘導(dǎo)和維持,對(duì)AD的學(xué)習(xí)和記憶能力的改善具有重要意義。
　　 AD主要

3、的病理特征是神經(jīng)細(xì)胞之間大量的老年斑(senile plaque,SP)和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NET),并伴有神經(jīng)元及突觸缺失。Β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)是構(gòu)成AD特征性病理改變-老年斑的核心物質(zhì),是β淀粉樣前體蛋白(beta amyloid precursor protein,APP)經(jīng)酶切后的毒性產(chǎn)物。研究表明,學(xué)習(xí)和記憶行為學(xué)改變與Aβ沉積關(guān)系極為密切

4、。因此,研究Aβ在AD發(fā)病過程中的作用對(duì)揭示AD的病理變化和防治機(jī)制都具有重要意義。
　　 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是保護(hù)和維持神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)突觸可塑性和神經(jīng)細(xì)胞活性的重要因子,在海馬依賴的學(xué)習(xí)和記憶調(diào)控中具有重要作用。BDNF參與調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)對(duì)腦的有益作用,并與突觸可塑性增強(qiáng)有關(guān)。
　　 在學(xué)習(xí)和記憶及突觸可塑性的機(jī)制研究中,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到關(guān)注。

5、大量研究證實(shí),IXP與學(xué)習(xí)和記憶形成的分子機(jī)制有高度一致性。因此,探討運(yùn)動(dòng)對(duì)誘導(dǎo)LTP的主要信號(hào)分子及其通路的影響,對(duì)于了解運(yùn)動(dòng)提高學(xué)習(xí)和記憶能力的相關(guān)機(jī)制有著重要的指導(dǎo)意義。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulatedkinase,ERK)/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response-element binding protein,CREB)信號(hào)途徑對(duì)突觸可塑性具有十分重要的作用。研究

6、提示,ERK/CREB信號(hào)途徑是記憶形成的調(diào)節(jié)途徑之一,長期過量的Aβ刺激,可導(dǎo)致ERK水平下調(diào),影響CREB磷酸化過程,引發(fā)記憶障礙。
　　 綜上所述,我們假設(shè),運(yùn)動(dòng)通過增強(qiáng)AD海馬的LTP來改善其學(xué)習(xí)和記憶損害可能與BDNF有關(guān),ERK-CREB通路的各元件因子可能發(fā)揮重要作用。
　　 本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用Aβ淀粉樣前體蛋白(β-Amyloid precursor protein,APP)/早老素基因1(preseni

7、lin-1,PS1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠,擬通過觀察跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶行為學(xué)、電生理學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)及分子生物學(xué)指標(biāo)的影響,分別從整體水平、細(xì)胞水平及蛋白分子水平,揭示跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)AD的防治效果,并進(jìn)一步闡明運(yùn)動(dòng)對(duì)AD作用的細(xì)胞和分子機(jī)制。本研究為AD的防治提供理論基礎(chǔ),對(duì)提高AD患者的生存質(zhì)量,改善其功能障礙,減輕家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。
　　 材料和方法：3月齡32只野生性小鼠及32只APP/PS1轉(zhuǎn)基

8、因小鼠各隨機(jī)分為兩組:野生型小鼠對(duì)照組(WtC)、野生型小鼠運(yùn)動(dòng)組(WtE)、轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組(TgC)、轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)組(TgE)。運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行2天適應(yīng)性訓(xùn)練后,開始正式訓(xùn)練。每天進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練30分鐘,以5m/min的速度開始運(yùn)動(dòng)5min,后以8m/min的速度持續(xù)運(yùn)動(dòng)5min,最后以11m/min的速度持續(xù)運(yùn)動(dòng)20min。
　　 5個(gè)月運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后,利用Morris水迷宮測(cè)試觀察各組小鼠學(xué)習(xí)和記憶行為學(xué)變化。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后

9、,小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)1周,隨后進(jìn)行電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　 電生理測(cè)試結(jié)束后,每組6只小鼠馬上斷頭取腦,剝離海馬,一半海馬快速投入液氮速凍,-80℃冰箱保存,待檢測(cè)BDNF、p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB和CREB的蛋白表達(dá)水平。另一半海馬加入Trizo1,-80℃冰箱保存,待檢測(cè)BDNF、ERK1/2和CREB的基因表達(dá)水平。每組另取6只小鼠腦進(jìn)行石蠟包埋,進(jìn)行HE染色、尼氏染色及Aβ的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。剩余小鼠電鏡觀察海

10、馬神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以X-±S表示,組問比較采用雙因素方差分析;電生理實(shí)驗(yàn)中群體鋒電位(population spike,PS)幅值及場(chǎng)興奮性突觸后電位(field-excitatorypostsynaptic potential,f-EPSP)斜率組內(nèi)比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn);隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期和路徑長度的組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析。LTP發(fā)生率采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有顯著性。

11、>　　 結(jié)果：
　　 1、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)學(xué)習(xí)和記憶能力的影響水迷宮結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)和記憶能力下降,跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)明顯改善轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶損害。
　　 2、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)海馬在體LTP的影響WtC組小鼠LTP發(fā)生率高于TgC組小鼠,并且僅在TgC組小鼠中發(fā)現(xiàn)LTD(long-term depression,LTD)。但是,各組小鼠LTP發(fā)生率差異不具顯著性(P＞0.05)。與野生型小鼠相比,轉(zhuǎn)基因小鼠海馬LTP

12、明顯減弱,運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬LTP。
　　 3、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)神經(jīng)病理學(xué)的影響HE和尼氏染色結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,排列稀疏,神經(jīng)元細(xì)胞核固縮多見,尼氏小體數(shù)量明顯減少,尼氏體分界不清。透射電鏡觀察結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)元可見細(xì)胞核變性、固縮,核膜模糊不清,部分溶解,不連續(xù),線粒體普遍腫脹,線粒體膜結(jié)構(gòu)不清,嵴紊亂,嵴數(shù)量減少或消失,部分線粒體出現(xiàn)空泡化。

13、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)減輕AD轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元的損傷程度。
　　 Aβ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠海馬DG區(qū)可見大量棕黃色Aβ呈團(tuán)簇樣或斑塊樣沉積,跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)使Aβ沉積明顯減少。
　　 4、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)BDNF基因和蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中BDNF基因和蛋白表達(dá)均上調(diào),運(yùn)動(dòng)可明顯降低轉(zhuǎn)基因小鼠BDNF基因和蛋白的表達(dá)水平。
　　 5、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)ERK1/2基因和蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)基因小鼠雖然出現(xiàn)ERK1/2基因和蛋

14、白表達(dá)水平上調(diào),但p-ERK1/2蛋白表達(dá)下調(diào);跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)提高野生型小鼠海馬p-ERK1/2和ERK1/2的基因和蛋白表達(dá)水平,但是運(yùn)動(dòng)下調(diào)AD轉(zhuǎn)基因小鼠ERK1/2基因和蛋白表達(dá),卻使p-ERK1/2蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　 6、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)CREB基因和蛋白表達(dá)的影響各組小鼠海馬組織中p-CREB及CREB基因和蛋白表達(dá)水平與p-ERK1/2和ERK1/2的表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　 結(jié)論：
　　 1、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)改善APP/

15、PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)和記憶的損害。
　　 2、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬DG區(qū)的LTP。
　　 3、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)的損害。
　　 4、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬DG區(qū)的Aβ沉積。
　　 5、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)使APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中的BDNF表達(dá)下調(diào)。
　　 6、ERK/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS