HNG對APP-PS1轉基因鼠保護作用及可能機制.pdf

1、目的：
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)亦稱老年性癡呆(senile dementia),是一種發(fā)生于中老年的以進行性認知障礙和記憶能力下降為主的退行性神經(jīng)病變。該病起病隱襲,病程呈進行性進展,以漸進性學習記憶、認知功能減退、行為異常、日常生活能力下降及情感、思維障礙等為主要臨床表現(xiàn)。其典型的病理改變是神經(jīng)細胞間出現(xiàn)大量以β-淀粉樣肽(β-Amyloid,Ap)為核心的老年斑(senile pl

2、aques,SP)、神經(jīng)元的胞體中出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(naeurofibrillary tangles,NFT)及神經(jīng)元的丟失等。AD的發(fā)病機制目前尚未完全闡明,但自由基損傷學說和細胞凋亡學說備受關注。自由基形成和氧化應激增強,進一步引起神經(jīng)細胞凋亡,是導致AD的功能退化和神經(jīng)變性的基礎。p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(P75 neurotrophin receptor,P75NTR)是神經(jīng)營養(yǎng)素的低親和力受體,與AD神經(jīng)元細胞凋亡有關。P75

3、NTR誘導凋亡的信號通路目前仍不十分清楚,但已被廣泛公認的是其對c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)的激活是介導神經(jīng)元細胞凋亡的關鍵步驟,然后進一步通過激活促凋亡蛋白P53、Bad等的表達,促進或引起細胞凋亡。此外,JNK還能通過誘導細胞色素C的釋放進一步活化Caspase-3而導致細胞凋亡。JNK(c-Jun N-terminal kinase,又稱應激活化蛋白激酶,SAPK)基因由JNK1

4、、JNK2和JNK3三條基因編碼,每條基因都表達出46kD及54kD蛋白,通過選擇性剪切產(chǎn)生十余個異構體。JNK1和JNK2在組織中廣泛表達,而JNK3則局限于腦、心臟等組織中表達。JNK信號通路屬絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路,多種刺激通過激酶級聯(lián)反應激活MAPKKK(包括MLK,K、ASK、MEKK、TAK1等)然后激活MAPKK(MKK4/7),最終激活JNK。
　　 JNK通路是真核生物細胞重要的信號轉導通路,參

5、與細胞增殖、發(fā)育、凋亡及多種生理和病理過程。JNK是一種特異性磷酸化核內轉錄因子 c-jun的激酶,通過使c-jun第63、73位絲氨酸雙磷酸化,提高其轉錄活性JNK/c-Jun通路在多種神經(jīng)元凋亡模型中激活,阻斷JNK/c-Jun通路活性可以保護神經(jīng)元免于凋亡。研究顯示JNK/c-Jun通路為神經(jīng)元凋亡所必需。直接阻斷轉錄因子c-Jun的活性可以很好的保護神經(jīng)元,提示c-Jun觸發(fā)一些靶基因的表達進而介導凋亡。大量研究表明,神經(jīng)元凋亡

6、過程中JNK的激活并發(fā)揮重要作用。研究證明JNK的活化是神經(jīng)元凋亡必需的。JNK存在多個底物,包括c-Jun,JunB、JunD、ATF2、Elk1、p53及NFAT等,從而介導不同的生物學過程,在神經(jīng)元凋亡過程中,JNK主要通過c-Jun傳導促凋亡信號?；罨腏NK通過和轉錄因子c-Jun的氨基末端區(qū)域結合,使轉錄因子的活性區(qū)域發(fā)生磷酸化,從而使c-Jun轉錄活性提高。激活的c-Jun在結合到其下游靶基因啟動子上的c-Jun DNA結

7、合,進而觸發(fā)基因的轉錄表達。研究表明,c-Jun的轉錄活性對神經(jīng)元凋亡是必需的。c-Jun基因突變小鼠的神經(jīng)元對凋亡刺激反應障礙,顯微注射特異性c-Jun抗體干擾其功能,或采用去除轉錄激活區(qū)保留DNA結合區(qū)的負顯性c-Jun突變體阻斷c-Jun的轉錄活性,均可有效地干預了神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。這此研究顯示神經(jīng)元凋亡時轉錄激活的c-Jun觸發(fā)了一些基因表達,而這些基因的表達對神經(jīng)元凋亡的發(fā)生起了關鍵作用。
　　 環(huán)磷酸腺苷反應元件結合

8、蛋白(CREB)是多種信號轉導通路的關鍵調節(jié)子,也是細胞內一個重要的信號分子,活化形式的CREB調節(jié)多種基因的表達。CREB是一種真核生物細胞核內的蛋白質,它的功能是調節(jié)基因的轉錄。通過Camp介導的信號轉導系統(tǒng),Camp與蛋白激酶A結合,進入細胞核內使CREB磷酸化,磷酸化的CREB可激活CREB調控的基因,表達產(chǎn)生長時記憶所需的蛋白質,在長時記憶中起重要作用。CREB在神經(jīng)保護方面的作用及參與的信號轉導機制己成為近年來神經(jīng)科學領域研

9、究的熱點。
　　 研究并建立可靠的AD動物模型對于探明AD的病因、發(fā)病機制及防治藥物的研發(fā)均有重要的意義。目前用于AD研究的動物模型類型多樣,其中轉基因模型是一種病因模型,是一種過量表達人源性突變AD相關基因的轉基因鼠,因其具有明確的病因,并能反映AD的部分病理與功能變化,有助于我們了解AD的發(fā)病機制,也逐漸成為研究AD的最為理想的整體模型。其中近年來研究的攜帶有瑞典突變的APP過表達及PS1外顯子9缺失的轉基因小鼠(APPsw

10、e/PS1dE9,APP/PS1)的出現(xiàn)為AD的進一步研究提供了更好的條件,該小鼠由Jackson實驗室成功研究,品系名為B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J,該小鼠是在鼠的蛋白酶因子啟動子元件的控制下,直接的將表達有一個嵌合的小鼠/人含有K595N/M596L瑞典突變的APP基因和一個攜帶有外顯子9缺失突變的人類PS1基因共轉入小鼠基因組中,使其主要表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元。APP/PS1小鼠在5個月時腦部

11、即出現(xiàn)Aβ表達及少量的Aβ沉積,呈現(xiàn)出早期AD的病理改變,到9個月時,可見更多的Aβ表達及大量的Aβ沉積,呈現(xiàn)明顯的AD的病理改變[27]。Lalonde等通過迷宮等行為學檢測發(fā)現(xiàn)該小鼠在7月齡時即出現(xiàn)明顯的學習記憶障礙,可部分的反映了AD的行為異常。因此該轉基因小鼠模型成為重要的用于AD發(fā)病及治療研究的動物模型。
　　 防治AD的抗氧化劑及抗凋亡藥物的研究與開發(fā)成為當今神經(jīng)病學研究領域的重要課題之一。Humanin(HN)是2

12、001年由Hashimoto等對阿爾茨海默病(AD)病人尸檢后,在枕葉提取出的一種含有開放讀碼框(ORF)的cDNA文庫,他們對這種cDNA文庫的表達進行了功能監(jiān)測,進而發(fā)現(xiàn)了一種編碼為24個氨基酸的多肽,稱之為Humanin。HN是1條由24個氨基酸殘基組成的線性多肽,分子量為2656.13。其一級結構為:et-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-As

13、p-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala。HN序列中包括三個部分,即以疏水的核心區(qū)GFSCLLLLTSEIDL為中心,兩側分別是極性的羧基端PVKRRA和氨基端MAPR。其中Pro3～Pro19為其功能核心區(qū),其編碼的氨基酸具有兩大功能:分泌功能和神經(jīng)保護功能。其核心區(qū)的Pro3、Ser7、Cys8、Leu9、Leu12、Thr13、Ser14和Pro19位點與HN的神經(jīng)保護作用密切相關,全長HN中任何一個位點被Ala

14、取代后將不再保護神經(jīng)元免于Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性作用。HN第8位的半胱氨酸殘基被丙氨酸殘基取代后,HN失去活性,第14位的絲氨酸被甘氨酸殘基取代后,即[Gly-14]-humanin(Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala,其分子量為2657.2,其神經(jīng)保護作用是HN的1000倍。如果將Le

15、u9替換成為精氨酸(L9R)則形成HNR,將沒有神經(jīng)保護的作用。最近的研究表明AGA-(C8R)-HNG17,HN17位變換氨基酸的衍生物,神經(jīng)保護作用比HN強十萬倍。HN的來源,Hashimoto等對阿爾茨海默病(AD)病人尸檢后,在枕葉中提取出了HN,而后TAJIMA等用抗HN抗體(p04)與HN免疫反應法分析發(fā)現(xiàn)HN免疫反應活性可在AD患者的枕葉中被檢測到,而AD患者的其它腦葉以及作為對照的者正常人腦中則檢測不到。對動物體內是否存

16、在與人類相同或者類似的神經(jīng)保護肽的研究表明,研究者已在大鼠、小鼠、猴子、線蟲等動物體內發(fā)現(xiàn)了HN的類似物。HN的作用方式是,Humanin是一種分泌型多肽,且分泌特性由其一級結構決定。它的Leu9-Leu12可形成一個疏水核心,使Humanin具有信號肽的結構特征。因此,當它與其它蛋白融合后即可發(fā)揮信號肽作用--啟動分泌過程。Yamagishi在探討Humanin的氨基酸組成與其分泌過程之間關系的研究中發(fā)現(xiàn),當Leu9、Leu10、Le

17、u11、Pro19和Va120分別被Arg取代后,Humanin的釋放被阻斷,表明Leu9-Leu11(正好鄰近起關鍵作用的Cys8)和Pro192Va120兩個結構域與Humanin的釋放關系密切。另外,Ser7和Leu9兩個位點對Humanin形成自身二聚體非常重要。在用Ala分別取代全長Humanin中任何一點氨基酸的研究中發(fā)現(xiàn),只有當Ser7或Leu9被取代時,不出現(xiàn)Humanin二聚體,表明這兩個位點與Humanin形成自身二

18、聚體密切相關。Humanin需分泌至胞外發(fā)揮作用,Humanin是一種分泌性多肽,當胞內Ca離子及Camp升高時其分泌量增加,而內質網(wǎng)-高爾基體轉運抑制劑BrefedinA則可阻斷其分泌,表明Humanin的分泌過程受到細胞內分泌機制的調控。實驗證明,Humanin被分泌至細胞外是其發(fā)揮作用的前提,其次是線性的Humanin必須形成二聚體,才能發(fā)揮生物學功能。
　　 因此,本研究擬通過遺傳性的APP/PS1轉基因小鼠,采用Nis

19、s1、TVNEL染色、免疫組化、Western blot等方法研究APP/PS1轉基因小鼠認知行為、病理改變、抗氧化能力、細胞凋亡、Aβ(1-40)、淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor Protein,APP)及P75-JNK-P53凋亡相關通路的影響,即9月齡的APP/PS1轉基因小鼠上述指標的改變,同時進一步探討HNG對APP/PS1轉基因小鼠模型的神經(jīng)保護作用及其可能的作用機制。
　　 材料與方法：

20、　　 實驗過程:取C57小鼠13只及APP/PS1小鼠24只,C57小鼠為對照組(Control)、APP/PS1小鼠24只隨機分為模型組(APP/PS1)和實驗組(APP/PS1+50μg/kg HNG)。實驗組APP/PS1轉基因小鼠按50μg/kg的劑量腹腔注射HNG,每日一次,連續(xù)腹腔注射2周;對照組及模型組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水,每日一次,連續(xù)腹腔注射2周。最后一周對小鼠進行水迷宮、避暗及自主活動等行為學檢測,其間繼續(xù)給

21、藥。行為學結束后,快速取一部分小鼠腦組織放入液氮中凍存,分別進行SOD、GSH-Px、MDA含量的測定及。Western blot印跡分析caspase-3、P75、c-Jun、P53等蛋白表達水平的實驗。另一部分小鼠進行灌流固定,取腦后分別行HE、Niss1、TUNEL染色及Aβ(1-40)、APP、CREB等指標的免疫組化檢測分析。
　　 實驗結果：
　　 1、HNG對APP/PS1轉基因小鼠記憶及判斷能力的影響

22、r>　　 水迷宮、避暗等行為學結果顯示APP/PS1轉基因小鼠出現(xiàn)明顯的學習記憶及判斷能力的下降,但活動能力未受影響。HNG明顯的改善了APP/PS1轉基因小鼠的學習記憶障礙,提高了小鼠的記憶與判斷能力。
　　 2、HMG對APP/PS1轉基因小鼠腦組織病理改變的影響
　　 HE染色及Niss1染色結果顯示,APP/PS1轉基因小鼠大腦神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,細胞排列松散,細胞核固縮、染色質邊集和核碎裂,尼氏體分界不清,排

23、列紊亂、松散,細胞周圍出現(xiàn)間隙,其中許多細胞胞體縮小、胞漿呈淡紅色、胞核固縮,可見壞死的神經(jīng)元;HNG明顯的減輕了APP/PS1轉基因小鼠腦內神經(jīng)元損傷程度,細胞排列相對整齊,細胞形態(tài)規(guī)則,層次豐富,核仁清晰。
　　 3、HNG對APP/PS1轉基因小鼠腦內Aβ(1-40)蛋白表達的影響
　　 Aβ(1-40)蛋白免疫組化染色結果顯示:APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層及海馬區(qū)的Aβ(1-40)蛋白表達水平顯著增高;HNG

24、能明顯抑制小鼠大腦皮層及海馬區(qū)的Aβ(1-40)蛋白表達水平。
　　 4、HNG對APP/PS1轉基因小鼠海馬區(qū)SOD、GSH-Px酶活性及MDA含量的影響
　　 化學比色法測定結果顯示APP/PS1轉基因小鼠海馬內SOD、GSH-Px活性明顯降低,MDA含量明顯升高;HNG能明顯的提高小鼠海馬內SOD、GSH-Px酶活性,并明顯的降低MDA含量。
　　 5、HNG對APP/PS1轉基因小鼠腦區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡的影

25、響
　　 TUNEL法染色結果顯示APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層及海馬區(qū)可見有較多的凋亡細胞,且細胞凋亡指數(shù)與空白對照組比明顯升高;HNG能明顯的減少APP/PS1轉基因小鼠大腦內神經(jīng)元細胞的凋亡。
　　 6、HNG對APP/PS1轉基因小鼠腦內APP蛋白表達的影響
　　 APP免疫組化染色分析結果顯示APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層及海馬區(qū)的APP蛋白表達水平明顯增高;HNG明顯的抑制了APP/PS1轉基因小

26、鼠大腦皮層及海馬區(qū)的APP蛋白表達水平的增高。
　　 7、HNG對APP/PS1轉基因小鼠腦內P75NTR、JNK及P53蛋白表達的影響
　　 Western blot印跡分析結果顯示APP/PS1轉基因腦內海馬內P75蛋白的表達水平增高,同時海馬區(qū)JNK2及P53蛋白表達水平增加;HNG可明顯的抑制p75ICD、JNK2及P53蛋白表達水平。
　　 8、HNG對APP/PS1轉基因小鼠腦內CREB蛋白表達的影響

27、
　　 CREB免疫組化染色分析結果顯示APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層及海馬區(qū)的CREB蛋白表達水平明顯降低;HNG明顯的促進了APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層及海馬區(qū)的CREB蛋白表達水平。
　　 結論：
　　 1、HNG能夠改善APP/PS1轉基因小鼠的學習記憶障礙。
　　 2、HNG能夠提高APP/PS1轉基因小鼠腦內的抗氧化酶活性,及降低MDA含量,發(fā)揮有效的抗氧化作用及增強記憶能力的作用。