AP39對APP-PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠和神經(jīng)元線粒體功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的發(fā)病機(jī)制中，線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及線粒體DNA突變可造成線粒體功能紊亂，表現(xiàn)為電子傳遞鏈?zhǔn)軗p、自噬增加、生物能量損傷、分裂融合障礙等，最終導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)元損傷。在 AD動物及患者體內(nèi)存在硫化氫（ Hyd ro gen sulfide, H2S）穩(wěn)態(tài)失衡現(xiàn)象。最近發(fā)現(xiàn)H2S的線粒體作用包括抗氧化，抗凋亡及調(diào)節(jié)維持細(xì)胞生物能量代謝。AP39是一種新合成的線粒

2、體靶向的H2S供體，其保護(hù)作用在其他體內(nèi)外模型中得以驗證。然而，AP39對 AD線粒體功能障礙可能的保護(hù)作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究為了明確AP39對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠和神經(jīng)元線粒體功能障礙的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　首先把 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠按照不同月齡分為3組（3、6、12month），水迷宮實驗（Morris water maze test）和新物體識別實驗（novel object recogni

3、tion task, NORT）觀察小鼠認(rèn)知功能的變化；亞甲基藍(lán)分光光度法檢測小鼠皮質(zhì)和海馬中H2S水平和體內(nèi)生成H2S的三1個酶的活性變化：胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine-γ-lyase, CSE)、胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-β-synthase, CBS)、3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3MST)；Western blot實驗分析

4、CSE、C BS、3MST三者蛋白的表達(dá)情況。APP/PS1孕鼠在妊娠期15-16(E15-16)天被處死，胎鼠腦被用來取材培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元。用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)方法鑒定神經(jīng)元。神經(jīng)元被不同濃度AP39處理后， MTT法檢測神經(jīng)元活力，LDH法檢測神經(jīng)元損傷，TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡，亞甲基藍(lán)分光光度法檢測神經(jīng)元中 H2S水平，熒光探針檢測線粒體中H2S的生成，XF24 Extracellular Flux Analyzer（細(xì)胞代謝

5、呼吸動態(tài)分析儀）檢測神經(jīng)元線粒體的呼吸功能。用 SiRNA干擾 SQR后對APP/PS1神經(jīng)元線粒體有氧呼吸的影響。不同濃度AP39處理后，線粒體呼吸酶復(fù)合物I-IV酶活性試劑盒檢測其各自的活性。ATP試劑盒檢測神經(jīng)元內(nèi) ATP的含量。PCR方法檢測核 DNA和線粒體 DNA（mtDNA）的完整性?；钚匝酰≧eactive Oxygen Species，ROS）試劑盒評估細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。線粒體膜電位（Mitochondrial me

6、mbrane potential assay）試劑盒檢測神經(jīng)元線粒體膜電位的變化。Western blot實驗分析線粒體融合分裂蛋白：融合蛋白1(Mito fus in1, Mfn-1)，融合蛋白2(Mitofusin2, Mfn-2)，視神經(jīng)萎縮癥蛋白(Optic atrophy-1, OPA-1)， Fis-1及動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein1, Drp1)的表達(dá)情況。
　　其次再將12月齡AP

7、P/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型（Wild-type,WT）小鼠分為四組，各組25只，分別是：WT小鼠 H2O處理對照組(WT+H2O)；WT小鼠 AP39處理組(WT+AP39)；APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠H2O處理組(APP/PS1+H2O)；APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠 AP39處理組(APP/PS1+AP39)。AP39或H2O每天一次通過腹腔注射治療小鼠6周，然后進(jìn)行Mo rris實驗和NORT測試。行為學(xué)測試后，各組小鼠行頭顱MRI

8、掃描，然后被處死收集血液和腦組織。將血液收集到肝素化管，4℃1000g離心10min，收集的上清液通過 ELISA試劑盒檢測 Aβ40和Aβ42水平。取得的腦組織通過透射電鏡檢測小鼠腦組織的線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)方法檢查腦組織Aβ沉積情況。
　　結(jié)果：
　　1.3、6、12月齡轉(zhuǎn)基因小鼠Mo rris和NORT實驗結(jié)果顯示：隨著月齡增長，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠尋找平臺的潛伏期越來越長，穿梭目標(biāo)象限的次數(shù)及滯留時間越來

9、越少，對新物體 B的認(rèn)知指數(shù)越來越低(p<0.01)。
　　2.隨著月齡增長，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)和海馬中H2S水平逐漸降低，其中12月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)和海馬中H2S水平降低最明顯(p<0.05)。
　　3.通過亞甲基藍(lán)分光光度計法檢測 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠組織內(nèi)CSE、CBS、3MST酶活性，發(fā)現(xiàn)CSE酶活性在肝臟中表達(dá)最強(qiáng)，在大腦皮質(zhì)和海馬組織中幾乎不表達(dá)。隨月齡不斷增長，大腦皮質(zhì)和海馬組織

10、中CBS和3MST酶活性呈降低趨勢，但3MST酶活性比CBS酶活性降低更為明顯(p<0.01)。用 Western blot方法檢測 CSE、CBS及3MS T的蛋白水平，結(jié)果與酶活性變化相似。Westernblot和細(xì)胞熒光免疫方法觀察到3MS T主要定位于神經(jīng)元線粒體中。
　　4. AP39可增加H2S的生成及調(diào)節(jié)WT神經(jīng)元線粒體能量代謝：WT神經(jīng)元經(jīng)不同濃度AP39處理2h后，亞甲基蘭法檢測H2S的生成水平。25-250n

11、M AP39可濃度依賴性地增加H2S的生成。在WT神經(jīng)元，100nM AP39可引起線粒體基礎(chǔ)呼吸速率顯著增加，而250nM AP39導(dǎo)致基礎(chǔ)呼吸速率明顯減少(p<0.01)。25,100nM AP39可引起FCCP誘導(dǎo)的線粒體最大呼吸速率劑量依賴性增加，但250nM AP39明顯降低了FCCP誘導(dǎo)的最大呼吸速率(p<0.01)。
　　5. AP39可增加APP/PS1神經(jīng)元細(xì)胞活力及降低LDH釋放量：不同濃度AP39處理WT神經(jīng)

12、元24h對細(xì)胞存活率和LDH釋放沒有明顯影響，但25,100nM AP39處理AP P/PS1神經(jīng)元24h可明顯增加細(xì)胞活力及降低LDH釋放量。TUNEL檢測凋亡結(jié)果顯示：APP/PS1神經(jīng)元中凋亡陽性神經(jīng)元數(shù)目比 WT神經(jīng)元中的凋亡陽性神經(jīng)元明顯增加（P<0.05），而25,100nM AP39處理神經(jīng)元24h后，凋亡陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著減少，但250nM AP39則會進(jìn)一步增加神經(jīng)元凋亡。
　　6. AP39可調(diào)節(jié)APP/PS1

13、神經(jīng)元線粒體呼吸功能且SQR參與其調(diào)節(jié)過程：用XF24 Extracellular Flux Analyzer測量線粒體生物能量結(jié)果顯示：APP/PS1神經(jīng)元線粒體生物能量學(xué)參數(shù)顯著降低（ P<0.05）。100nM AP39可顯著增加APP/PS1神經(jīng)元的線粒體基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率（P<0.01）。干擾SQR后，APP/PS1神經(jīng)元的基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率降低（P<0.01）.
　　7. AP39可保護(hù)線粒體功能：AP

14、P/PS1神經(jīng)元線粒體呼吸鏈復(fù)合物I-IV活性均降低，而100nM AP39可明顯增加APP/PS1神經(jīng)元線粒體呼吸鏈復(fù)合物 I-IV活性（P<0.01）。 AP39顯著增加了 WT神經(jīng)元和APP/PS1神經(jīng)元的ATP產(chǎn)物。AP39可部分恢復(fù)APP/PS1神經(jīng)元mtDNA的完整性。100nM AP39可有效降低APP/PS1神經(jīng)元的RO S水平及恢復(fù)APP/PS1神經(jīng)元的線粒體膜電位損傷。
　　8. AP39可調(diào)節(jié)APP/PS1神

15、經(jīng)元線粒體動態(tài)平衡：通過Western blot實驗分析參與線粒體動態(tài)平衡的蛋白水平。APP/PS1神經(jīng)元的線粒體融合蛋白Mfn1和OPA1水平顯著降低（P<0.01），線粒體裂變蛋白Fis1水平顯著增加（P<0.05），Mfn2和Drp1蛋白水平無明顯差異。100nM AP39可明顯增強(qiáng)OPA1和Mfn1的蛋白表達(dá)，而顯著降低F is1的蛋白水平（P<0.01）。
　　9.25-250 nM AP39可劑量依賴性地增加WT和AP

16、P/PS1小鼠皮層和海馬中H2S的生成。
　　10. AP39可部分逆轉(zhuǎn) APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶障礙：用100n M/Kg AP39分別處理12月齡AD小鼠和WT小鼠6周，Mo rris和NORT實驗結(jié)果如下：WT小鼠隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，探索平臺潛伏期縮短，學(xué)習(xí)與記憶能力不斷增強(qiáng)；相比 WT野生型小鼠，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠探索平臺潛伏期較長，穿越平臺所在象限(目標(biāo)象限)的次數(shù)和滯留時間較少（P<0.01），AD模型小鼠

17、行為表現(xiàn)較差，探索新物體 B的時間百分比顯著減少（P<0.01）；而100nM/kg AP39治療6周后降低了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠探索隱藏平臺的潛伏期，學(xué)習(xí)能力也不斷增強(qiáng)，對目標(biāo)象限表現(xiàn)出強(qiáng)烈的偏好，對新物體 B認(rèn)知指數(shù)顯著增高（P<0.05）。25nM/kg AP39不能改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)障礙。
　　11. AP39可部分抑制 AP P/P S1轉(zhuǎn)基因小鼠的腦萎縮：小鼠頭顱MRI結(jié)果顯示：WT小鼠沒有明顯大腦

18、結(jié)構(gòu)異常，兩側(cè)大腦半球側(cè)腦室大小對稱，邊緣清晰。用H2O處理的12月齡APP/PS1小鼠大腦萎縮明顯且側(cè)腦室極為不對稱，側(cè)腦室左側(cè)較右側(cè)偏大且邊緣不清楚，頂葉皮層和海馬區(qū)的ADC值出現(xiàn)顯著下降；而AP39可緩解AD模型小鼠的腦萎縮和側(cè)腦室不對稱，顯著增加APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠頂葉皮層和海馬的ADC值(P<0.01)。
　　12. AP39對APP/PS1小鼠腦組織線粒體形態(tài)的影響：透射電鏡結(jié)果如下：WT小鼠腦組織神經(jīng)元線粒體形態(tài)

19、基本正常，而APP/P S1小鼠腦組織神經(jīng)元可觀察到線粒體出現(xiàn)嚴(yán)重結(jié)構(gòu)損傷，明顯腫脹破裂，輪廓模糊，染色質(zhì)深，出現(xiàn)分散的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體小體，且細(xì)胞質(zhì)中有明顯的空泡形成。經(jīng)AP39處理的APP/PS1小鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)類似于 WT小鼠神經(jīng)元：線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴排列整齊，結(jié)構(gòu)正常。
　　13. AP39可降低AP P/P S1轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ水平及抑制Aβ沉積：各組小鼠腦組織ELIS A結(jié)果顯示：12月齡的AP

20、P/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)Aβ40和Aβ42的水平分別為：925.59和532.15 pg/ml；AP39處理后Aβ40和Aβ42水平顯著降低，結(jié)果分別為：531.34和365.28 pg/ml。免疫組化結(jié)果如下：在WT小鼠尚未觀察到淀粉樣蛋白斑塊（amyloid-β, Aβ）沉積；而相比WT小鼠，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)的Aβ沉積數(shù)量和所占面積顯著增加；AP39治療顯著抑制了AD小鼠皮層和海馬組織中的Aβ斑塊數(shù)量和大小(P<

21、0.01)。
　　結(jié)論：
　　隨著年齡增長，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能越來越差；大腦皮質(zhì)和海馬中H2S水平逐漸降低，CBS和3MST酶活性和蛋白水平逐漸降低，且3MS T酶活性及蛋白水平比C BS降低程度更為明顯；3MS T主要位于神經(jīng)元線粒體中。這些結(jié)果表明神經(jīng)元線粒體的 H2S主要是由3MS T負(fù)責(zé)產(chǎn)生。AP39可增加神經(jīng)元內(nèi)H2S的生成，尤其是線粒體中H2S的生成。AP39對WT神經(jīng)元中線粒體能量代謝呈現(xiàn)出雙相調(diào)