DISC1改善阿爾茨海默病APPswe-PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因模型鼠認(rèn)知功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文從以下幾章進(jìn)行探討：
　　第一章 DISC1基因在阿爾茨海默病APPswe/PSIdE9轉(zhuǎn)基因模型小鼠腦中表達(dá)情況的研究
　　目的:研究APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦中DISC1的表達(dá)情況。
　　方法:抓取3對(duì)4個(gè)月齡和8個(gè)月齡大的野生小鼠和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，麻醉后斷頸處死小鼠后立即剝離鼠腦，分離海馬和皮層，液氮凍存。取部分凍存的鼠腦海馬和皮層提組織總蛋白，進(jìn)行凝膠電泳和免疫印記檢測(cè)DISC1蛋白水平。

2、r>　　結(jié)果:在4月齡大小時(shí)，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生小鼠無(wú)論是海馬還是皮層，其DISC1蛋白表達(dá)水平均沒有顯著差異;而在8月齡大小時(shí)，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層和海馬中DISC1蛋白水平均顯著低于野生小鼠皮層和海馬中DISC1蛋白水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠在8個(gè)月齡大小時(shí)，DISC1基因表達(dá)顯著降低;阿爾茨海默病與精神分裂癥有共同的異常表達(dá)基因，二者可能具有內(nèi)在相關(guān)性。

3、r>　　第二章 DISC1過(guò)表達(dá)特異性下調(diào)BACE1蛋白水平
　　目的:探索DISC1對(duì)BACE1的調(diào)控作用。
　　方法:培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，將DISC1-Flag質(zhì)粒與BACE1-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染作為實(shí)驗(yàn)組，并將GFP質(zhì)粒與BACE1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染作為對(duì)照，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BACE1-HA的蛋白水平和RNA水平;培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染DISC1-Flag質(zhì)粒或GFP質(zhì)粒后，檢測(cè)內(nèi)源性BACE1的蛋白水平和RNA水平;培養(yǎng)HE

4、K293細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染DISC1干擾RNA或?qū)φ崭蓴_RNA，檢測(cè)DISC1與BACE1蛋白水平和RNA水平。
　　結(jié)果:培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞用DISC1-Flag質(zhì)粒和BACE1-HA質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后收樣檢測(cè)BACE1-HA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)DISC1顯著降低了BACE1的蛋白水平，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;因?yàn)镠EK293細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)BACE1，因此，我們用DSIC1-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后48

5、小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性BACE1蛋白，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DISC1能顯著降低HEK293細(xì)胞內(nèi)源性BACE1蛋白水平，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。人DISC1基因干擾RNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，HEK293細(xì)胞DISC1蛋白水平顯著比轉(zhuǎn)染對(duì)照干擾RNA的細(xì)胞的DISC1蛋白水平要低，而BACE1蛋白水平顯著增高，二都差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，HEK293細(xì)胞做為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染DISC1-Flag質(zhì)粒和DISC1干擾RNA及相應(yīng)的對(duì)照后，提取細(xì)胞

6、總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)DISC1和BACE1的RNA水平發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染DISC1-Flag可以顯著提高DISC1的RNA水平，而轉(zhuǎn)染DISC1-siRNA可以顯著降低DISC1的RNA水平，但是無(wú)論何種調(diào)控DISC1表達(dá)，BACE1的RNA表達(dá)量均沒有顯著改變。
　　結(jié)論:DISC1可以特異性調(diào)控BACE1蛋白水平，但是對(duì)BACE1的RNA表達(dá)沒有調(diào)控作用。
　　第三章 DISC1過(guò)表達(dá)特異性下調(diào)BACE1蛋白水平的機(jī)制研

7、究
　　目的:探索DISC1調(diào)控BACE1蛋白水平的分子機(jī)制。
　　方法:培養(yǎng)HEK293細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，用DISC1-Flag質(zhì)粒與BACE1-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，24小時(shí)后用4％多聚甲醛固定細(xì)胞爬片，進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)DISC1-Flag與BACE1-HA共定位情況;培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，用DISC1-Flag質(zhì)粒與BACE1-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，24小時(shí)后收樣提總蛋白，分別用HA抗體和Flag抗體進(jìn)行免疫共沉淀，檢測(cè)DI

8、SC1-Flag和BACE1-HA的相互結(jié)合情況;取2月齡大小野生型小鼠的海馬，提海馬組織總蛋白，分別用DISC1抗體和BACE1抗體進(jìn)行免疫共沉淀檢測(cè)小鼠海馬中DISC1與BACE1的相互結(jié)合情況。培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染DISC1和GFP，18小時(shí)后用CHX處理，分別于處理0、8、16小時(shí)細(xì)胞收樣檢測(cè)BACE1蛋白水平;培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染DISC1和GFP，轉(zhuǎn)染后立即用DMSO(Vehicle)、CQ、MG132處

9、理，48小時(shí)后收樣檢測(cè)BACE1蛋白水平。
　　結(jié)果:HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染DISC1-Flag和BACE1-HA，用Flag抗體和HA抗體進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DISC1與BACE1有共定位，而且均位于細(xì)胞核周圍域;對(duì)共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀，分別用Flag抗體和HA抗體去拉下DISC1-Flag和BACE1-HA，進(jìn)行免疫印記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BACE1-HA可以拉下DSIC1-Flag，DISC1-Flag也可以

10、拉下BACE1-HA;取2個(gè)月齡大的C57BL/6J小鼠鼠腦海馬，提取組織總蛋白并分別用DISC1抗體和BACE1抗體進(jìn)行免疫共沉淀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DISC1與BACE1在小鼠腦內(nèi)仍有直接相互結(jié)合作用這些結(jié)果表明DISC1與BACE1有直接的相互結(jié)合。CHX藥物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DISC1轉(zhuǎn)染后BACE1于藥物處理后8小時(shí)和16小時(shí)，BACE1蛋白水平要顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(8h: t=3.504，P=0.013;16h: t=2.611，

11、P=0.040); CQ和MG132藥物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CQ能抑制BACE1的降解，并可抑制DISC1轉(zhuǎn)染后對(duì)BACE1降解的促進(jìn)作用，CQ處理后DISC1轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組BACE1蛋白水平?jīng)]有顯著差異，但是MG132處理不能抑制BACE1的降解作用，也不能抑制DISC1轉(zhuǎn)染后對(duì)BACE1降解的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論:DISC1與BACE1有直接的物理結(jié)合，而且DISC1通過(guò)溶酶體途徑促進(jìn)BACE1蛋白降解;BACE1主要通過(guò)溶酶體途徑降解。

12、
　　第四章 DISC1過(guò)表達(dá)改善APPswe/PSIdE9轉(zhuǎn)基因模型鼠神經(jīng)病理和認(rèn)知功能
　　目的:研究DISC1對(duì)內(nèi)源性BACE1的調(diào)控作用，以及DISC1對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦中老年斑形成的影響和對(duì)AAPP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠記憶障礙的影響。
　　方法:將小鼠分為WT+GFP（野生型小鼠注射GFP病毒）、TG+GFP(APP/PS1小鼠注射GFP病毒)、TG+DISC1(APP/PS1小鼠注射DISC1病

13、毒)三組，每組15只，于4個(gè)月齡大小時(shí)分別給小鼠海馬注射GFP病毒和DISC1病毒，并于病毒注射后3.5月進(jìn)行水迷宮檢測(cè)評(píng)估DISC1對(duì)小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能的作用。水迷宮檢測(cè)結(jié)束后，將所有小鼠全部麻醉后斷頸處死，立即剝離腦組織分成左右兩部分。一側(cè)用4％多聚甲醛固定后蔗糖脫水，冰凍切片以進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。另一部分腦組織分離海馬和皮層后-80凍存，用于檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)。取小鼠的冰凍切片用6E10抗體做免疫熒光染色檢測(cè)小鼠腦中老年斑的數(shù)量和面積。

14、取凍存的小鼠皮層和海馬組織，按ELISA試劑盒提供的方法步驟進(jìn)行組織樣本制備后進(jìn)行ELISA檢測(cè)Aβ40和Aβ42的水平。取凍存的海馬組織提取總蛋白后進(jìn)行免疫印記檢測(cè)APP、α/β-CTF、DISC1-Flag的表達(dá)情況，并統(tǒng)計(jì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果:免疫熒光染色和免疫印記檢測(cè)結(jié)果證實(shí)病毒可以準(zhǔn)確注射到小鼠海馬齒狀回并穩(wěn)定表達(dá)至少4個(gè)月，而且小鼠海馬中過(guò)表達(dá)DISC1后下調(diào)了海馬中BACE1蛋白水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.98

15、4，P=0.005);而DISC1過(guò)表達(dá)不能改變BACE1的RNA表達(dá)水平，結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠逃生潛伏期和逃生距離顯著長(zhǎng)于野生小鼠和DISC1病毒注射組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠(Day6:F=10.057，P=0.001);而三組小鼠的游泳速度沒有顯著差異，說(shuō)明三組小鼠間的逃生潛伏期和逃生距離的差異不是游泳速度不同引起的;反向平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組APP/PS1小鼠的逃生潛伏期也顯著長(zhǎng)于D

16、ISC1病毒注射組小鼠和野生型小鼠(Day1: F=4.468，P=0.022;Day2:F=15.834，P=0.000)。對(duì)照組與DISC1組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬免疫印記結(jié)果顯示DISC1病毒注射可以降低β-CTF水平(t=5.252，P=0.013)，而α-CTF(t=1.615，P=0.205)和APP(t=0.742，P=0.512)則沒有顯著改變。ELISA結(jié)果顯示兩組APP/PS1小鼠皮層中Aβ40(t=0.906

17、，P=0.386)和Aβ42(t=0.112，P=0.913)水平基本相同，而DISC1病毒注射組APP/PS1小鼠海馬中Aβ40和Aβ42水平顯著要低于對(duì)照病毒組APP/PS1小鼠海馬中Aβ40和Aβ42水平(Aβ40:t=10.696，P=0.000; Aβ42:t=16.293，P=0.000)。老年斑免疫熒光檢測(cè)結(jié)果提示與對(duì)照病毒組APP/PS1小鼠相比較，DISC1病毒注射組小鼠海馬中老年斑的數(shù)量和面積都要顯著減少（數(shù)量:t=

18、9.475，P=0.000;面積:t=6.799，P=0.000）;而兩組小鼠皮層的老年斑數(shù)量和面積沒有差異(數(shù)量:t=0.204，P=0.840;面積:t=0.573，P=0.570)。
　　結(jié)論:DISC1過(guò)表達(dá)能下調(diào)小鼠海馬內(nèi)BACE1蛋白水平，但不影響其RNA水平;DISC1過(guò)表達(dá)可以通過(guò)下調(diào)BACE1蛋白水平減少其對(duì)APP的淀粉蛋白途徑降解，從而降低海馬中β-CTF、Aβ40、Aβ42水平，并最終減少老年斑形成;海馬注射