賴氨酰tRNA合成酶的啟動(dòng)子研究.pdf

1、氨酰tRNA合成酶是一類能催化tRNA與特定氨基酸前體發(fā)生酯化反應(yīng)的酶,氨酰tRNA合成酶不但是蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的一類重要的酶,還參與了轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的調(diào)控、RNA剪接、信號(hào)傳導(dǎo)以及免疫等生命活動(dòng)。自然界中存在2種結(jié)構(gòu)完全不同的賴氨酰tRNA合成酶LysRS-Ⅰ、LysRS-Ⅱ,負(fù)責(zé)賴氨酸密碼子的翻譯,而蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus ATCC14579)中存在賴氨酰-tRNA合成酶Ⅰ(1ysRSⅠ)和lysRSⅡ兩種基因

2、,lysRSⅠ是非必須基因,而lysRSⅢ是必須基因,lyysRSⅠ前期不表達(dá),后期表達(dá),因此lysRSⅠ基因受到啟動(dòng)子的嚴(yán)格調(diào)控。因此研究lysRSⅠ啟動(dòng)子對(duì)研究B.c中l(wèi)ysRSⅠ基因的生物學(xué)功能有非常重要的意義。
　　 1,構(gòu)建了不同長(zhǎng)度lysRSⅠ基因啟動(dòng)子,分別敲除掉啟動(dòng)子5'端300bp、393bp和662bp長(zhǎng)度的片段,通過(guò)基因工程的方法將GFP基因片段連接到啟動(dòng)子3'端之后,構(gòu)建了不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子的基因工程菌,并研

3、究了所構(gòu)建的基因工程菌的熒光表達(dá)情況,通過(guò)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除掉393bp片段后,GFP并沒(méi)有表達(dá),而敲除掉300bp和662bp基因片段后,GFP的表達(dá)情況并沒(méi)有受到影響,并且當(dāng)敲除掉662bp的片段后,熒光強(qiáng)度更加強(qiáng)。
　　 2,我們進(jìn)一步研究了lysRSⅠ基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),通過(guò)反轉(zhuǎn)錄加G尾,然后測(cè)序的方法,我們尋找到了lysRSⅠ基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),其位于5'端371bp的位置,這個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與我們上述得到的現(xiàn)象一致,

4、解釋了上述觀察到的現(xiàn)象,但并沒(méi)能解釋敲除662bp后的熒光現(xiàn)象,因此,我們進(jìn)一步研究了B.c14579-pUBC-P662-GFP的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),通過(guò)同樣的方法,我們確定敲除662bp后,其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于pUBC19質(zhì)粒上。
　　 3,我們?cè)趐UBC19質(zhì)粒緊靠啟動(dòng)子的5'端插入t1t2轉(zhuǎn)錄終止子,通過(guò)基因工程的辦法將不同長(zhǎng)度lysRSⅠ基因啟動(dòng)子連到終止子之后,觀察插入終止子后對(duì)GFP表達(dá)的影響,通過(guò)實(shí)驗(yàn),我們可以看出,插入

5、終止子后對(duì)B.c14579-pUBC—P300-GFP和B.c14579-pUBC-pLys-GFP的熒光強(qiáng)度沒(méi)有影響,但對(duì)B.c14579-pUBC-P662-GFP的熒光影響較明顯,這更進(jìn)一步驗(yàn)證了敲除662bp后的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于pUBC9質(zhì)粒上。
　　 4,我們對(duì)lysRSⅠ啟動(dòng)子進(jìn)行了6個(gè)突變,并且觀察了不同突變后的熒光效果,突變主要圍繞lysRSⅠ基因啟動(dòng)子上的莖環(huán)結(jié)構(gòu),通過(guò)突變我們研究了莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)lysRSⅠ基因表