金黃色葡萄球菌L-乳酸脫氫酶生物學(xué)功能研究.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種能造成嚴(yán)重社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的致病菌，它不僅可以引起皮膚粘膜膿腫、中耳炎等常見(jiàn)感染,還可以引起腦膜炎和菌血癥等嚴(yán)重感染。金黃色葡萄球菌引發(fā)感染的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，這已經(jīng)引起了人們的高度重視。乳酸脫氫酶（ lactate dehydrogenase，LDH）催化丙酮酸和乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化,它對(duì)于金黃色葡萄球菌保持毒力、逃避宿主的先天性免

2、疫以及生物膜形成是至關(guān)重要的。因此，本研究在前期對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌L-乳酸脫氫酶的克隆、表達(dá)的基礎(chǔ)上，制備多克隆抗體，分析其免疫活性及交叉反應(yīng)性，并進(jìn)一步分析了該多克隆抗體對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響,為其后續(xù)診斷、治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　復(fù)蘇pET28a-ldh1/Bl21重組菌，提取pET28a-ldh1重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。IPTG誘導(dǎo)重組融合蛋白表達(dá)、以抗His標(biāo)簽的單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡法

3、（Western-blot）鑒定重組蛋白。以IPTG誘導(dǎo)后，溶菌酶以及超聲裂解后收集上清，Ni2+柱純化蛋白。透析和濃縮純化蛋白后分析其酶活性和理化性質(zhì)。使用純化的重組蛋白以及相應(yīng)的佐劑免疫小鼠，收集小鼠抗血清，利用ELISA測(cè)定血清抗體效價(jià)。以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后，使用小鼠抗血清進(jìn)行免疫印跡法鑒定重組蛋白的免疫反應(yīng)性。收集金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌以及重組

4、菌，經(jīng)溶菌酶和超聲破裂后離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后進(jìn)行Western-blot鑒定L-乳酸脫氫酶多克隆抗體的交叉反應(yīng)性。最后以結(jié)晶紫為染料，30％的醋酸為脫色劑，于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，進(jìn)一步分析該多克隆抗體對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響。
　　結(jié)果：
　　重組質(zhì)粒pET28a-ldh1雙酶切后獲得大小約950 bp的目的條帶，誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE電泳在約39 KDa處可見(jiàn)目的條帶，免疫

5、印跡法驗(yàn)證了重組L-LDH的表達(dá)。Ni2+柱純化后獲得2.8 mg重組蛋白，酶活性為14100 U/L，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)該重組蛋白為四聚體。純化蛋白免疫小鼠能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答， ELISA檢測(cè)特異性IgG效價(jià)，小鼠抗血清效價(jià)達(dá)1:50000。Western-blot鑒定顯示所制備的多克隆抗血清能分別識(shí)別金黃色葡萄球菌重組及天然L-乳酸脫氫酶，但不識(shí)別表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌中天然乳酸脫氫酶。生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)

6、顯示該多克隆抗體在稀釋倍數(shù)為1:1000時(shí)抑制率為66.4%，在稀釋倍數(shù)為1:2000時(shí)的抑制率為41.4%，在稀釋倍數(shù)為1:4000時(shí)的抑制率為16.2%。
　　結(jié)論：
　　純化的L-LDH具有良好的免疫活性，免疫小鼠獲得高滴度的多克隆抗體。使用 Western-blot鑒定顯示該多克隆抗體具有很好的特異性。并且該多克隆抗體對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成具有一定的抑制作用。為后續(xù)使用該重組蛋白進(jìn)行金黃色葡萄球菌感染的診斷和防治