染矽塵大鼠肺泡上皮細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：觀察與染矽塵大鼠肺泡上皮細(xì)胞（AEC）共培養(yǎng)能否誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( BMMSCs)分化為AEC。
　　方法:1、隨機(jī)取6只無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)健康雄性SD大鼠，采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMMSCs。2、隨機(jī)取同批大鼠14只，其中7只以1.0 mL質(zhì)量濃度為40 g/L的矽塵混液氣管內(nèi)注入制作染矽塵大鼠模型，用免疫粘附純化法培養(yǎng)染矽塵大鼠AEC，另7只注入0.9％氯化鈉溶液1.0 mL作為正常對(duì)照大鼠，采用免疫粘附純化

2、法培養(yǎng)正常大鼠AEC。3、設(shè)置實(shí)驗(yàn)組：以BMMSCs與染矽塵大鼠AEC兩種細(xì)胞共培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照A組：以BMMSCs和正常大鼠AEC兩種細(xì)胞共培養(yǎng)作為對(duì)照A組，對(duì)照B組：以BMMSCs單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照B組。4、分別于共培養(yǎng)第4天和第8天時(shí)，以倒置熒光顯微鏡（IFM）觀察各組BMMSCs的形態(tài)變化。5、分別于共培養(yǎng)第4天和第8天時(shí)，對(duì)各組BMMSCs進(jìn)行水通道蛋白5（AQP5）和表面活性蛋白C（SP-C）免疫熒光雙重染色，分別用IFM

3、和激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察BMMSCs的熒光表達(dá)情況，采用Image-pro plus6.0圖像分析軟件對(duì)兩種顯微鏡下2種蛋白的熒光進(jìn)行積分光密度（IOD）分析。6、分別于共培養(yǎng)第4天和第8天時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組BMMSCs中AQP5和SP-C兩種信使RNA(mRNA）的表達(dá)水平。7、分別于共培養(yǎng)第4天和第8天，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGFβ1）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的濃度

4、。
　　結(jié)果：1、各組細(xì)胞形態(tài)觀察顯示，共培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照A組的BMMSCs逐漸從長(zhǎng)梭形向立方形和多邊形轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)第8天時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化較第4天更明顯，但對(duì)照A組BMMSCs在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)形態(tài)變化無(wú)實(shí)驗(yàn)組明顯，對(duì)照B組BMMSCs的形態(tài)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化。2、IFM和LSCM觀察顯示：在共培養(yǎng)第4天和第8天，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照A組BMMSCs均可見呈綠色熒光的AQP5和紅色熒光的SP-C表達(dá)，對(duì)照B組BMMSCs在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均可見

5、少量AQP5綠色熒光表達(dá)，均無(wú)SP-C紅色熒光表達(dá)，相較于IFM，LSCM可清晰地觀察不同蛋白的表達(dá)及其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。3、IOD分析顯示：在共培養(yǎng)第4天和第8天，IFM和LSCM所得BMMSCs的2種蛋白熒光IOD值在實(shí)驗(yàn)組均較同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照A組和對(duì)照B組增強(qiáng)（P＜0.01），而對(duì)照A組BMMSCs的2種蛋白熒光IOD值又均較相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照B組增強(qiáng)（P＜0.01）；在不同時(shí)間點(diǎn)之間進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照A組的BMMSCs在第8天時(shí)2

6、種蛋白的熒光IOD值均較同組第4天時(shí)增強(qiáng)（P＜0.01）。將兩種顯微鏡所得IOD進(jìn)行比較,除對(duì)照B組的SP-C蛋白熒光IOD外，IFM所得3組BMMSCs的2種蛋白熒光IOD均高于同組LSCM所得（P＜0.01）。4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組AQP5和SP-C mRNA表達(dá)水平較對(duì)照A組和對(duì)照B組均高（P＜0.01），對(duì)照A組較對(duì)照B組高（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照A組在共培養(yǎng)第8天時(shí)mRNA表達(dá)量均較第4天高（P

7、＜0.01）。5、TGFβ1和EGF濃度檢測(cè)顯示：在相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1濃度較對(duì)照A組和對(duì)照B組均低（P＜0.01）， EGF濃度較對(duì)照A組和對(duì)照B組均高（P＜0.01），對(duì)照A組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1濃度較對(duì)照B組低（P＜0.01），EGF濃度較對(duì)照B組高（P＜0.01）；相同組別兩時(shí)間點(diǎn)間比較，TGF-β1濃度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01），EGF濃度實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照A組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。