CGRP在骨修復(fù)與炎癥性骨疾病中的生物學(xué)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:骨具有修復(fù)再生的獨(dú)特能力，這歸于一系列控制骨愈合的細(xì)胞和分子參與了這個(gè)復(fù)雜的過程并調(diào)控骨骼的生長(zhǎng)和發(fā)育。骨修復(fù)中的一個(gè)重要組成部分就是骨細(xì)胞的行為。骨這種本身存在的緊密耦合對(duì)骨骼系統(tǒng)的正常功能及維持至關(guān)重要。
　　骨骼系統(tǒng)的主要功能包括:1.提供對(duì)器官組織的支持2.調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)。骨的改建與重構(gòu)過程主要由兩個(gè)主要類型的細(xì)胞即成骨細(xì)胞所帶來的骨形成和破骨細(xì)胞造成的骨降解而完成的。這個(gè)過程正是由這些細(xì)胞的發(fā)展和激活所緊密調(diào)節(jié)的;當(dāng)

2、然，也是由一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路所參與介導(dǎo)的。
　　目前，已經(jīng)被證明ERK通路、OPG/RANKL通路、BMP-2/Smads通路和Wnt信號(hào)等多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在整個(gè)成骨細(xì)胞分化增殖過程中都起著重要的作用。但由于這個(gè)過程本身較為復(fù)雜，所以具體的調(diào)控機(jī)制還不是十分明確。近年來在骨代謝方面，尤其是神經(jīng)分泌的神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)對(duì)成骨細(xì)胞的影響成為了研究熱點(diǎn)，這為研究骨的生長(zhǎng)發(fā)育、修復(fù)、以及相關(guān)疾病的治療帶來了新的方向。
　　CGRP受體

3、屬于G蛋白偶聯(lián)家族成員，是由七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白即降鈣素受體樣受體(CRLR)和輔助蛋白，受體活性修飾蛋白（RAMP1）。此外，CGRP受體組分蛋白(RCP)作為胞漿蛋白，似乎是有效的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需要的信號(hào)。而CGRP正是能激活這種受體相關(guān)的異三聚體的蛋白。
　　進(jìn)一步的證據(jù)表明CGRP在骨中起著重要作用能影響成、破骨細(xì)胞的功能。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠成骨細(xì)胞過表達(dá)CGRP能夠使骨密度增加。此外，在各種成骨細(xì)胞系及正常人成骨細(xì)胞樣

4、細(xì)胞上均發(fā)現(xiàn)CT和CGRP及其受體的mRNA的表達(dá)。CGRP還能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖以及胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP能通過其受體受體刺激c-AMP活性和磷脂酶分別刺激活化蛋白激酶A(PKA)，并增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣的水平以及蛋白激酶C(PKC)激活。此次研究首先關(guān)注了CGRP受體所介導(dǎo)的誘導(dǎo)成骨分化的功能，明確CGRP在促進(jìn)骨修復(fù)中的涉及的相關(guān)機(jī)制，同時(shí)也初步探索了在炎癥性骨疾病中CGRP潛在的保護(hù)作用，以期為CGRP的在

5、骨創(chuàng)傷愈合中的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　在研究CGRP受體所介導(dǎo)的誘導(dǎo)成骨分化的功能的試驗(yàn)中，首先利用慢病毒載體的構(gòu)建，穩(wěn)定敲除了CGRP受體RAMP1的表達(dá)，熒光定量PCR，WB，以及免疫熒光檢測(cè)敲除RAMP1后對(duì)CGRP受體表達(dá)的影響。又通過細(xì)胞增殖測(cè)定，骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)的檢測(cè)和茜素紅染色等方法，檢測(cè)了敲除RAMP1后對(duì)CGRP誘導(dǎo)成骨細(xì)胞活性和分化的影響。結(jié)果表明，在成骨細(xì)胞中敲除RAMP1會(huì)導(dǎo)致CRLR表達(dá)和在細(xì)胞膜分布

6、的抑制。此外，RAMP1的穩(wěn)定敲除會(huì)抑制CGRP誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性，會(huì)減少Runx2和Ⅰ型膠原的mRNA的表達(dá)以及礦化沉積。還發(fā)現(xiàn)，敲除RAMP1會(huì)抑制CGRP刺激的成骨細(xì)胞c-AMP的水平。
　　此外，在本次實(shí)驗(yàn)中，還首次探討了CGRP對(duì)于LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的影響。同時(shí)，也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證，并探討CGRP在LPS誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型牙周組織中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一<

7、br>　　(1).用不同濃度的CGRP處理MG63細(xì)胞1，4，7天后，采用CCK-8法檢測(cè)CGRP對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CGRP能夠顯著增加成骨細(xì)胞的增殖活性，且最佳濃度在10-8 M。此外，ALP活性也被檢測(cè)。不同劑量的CGRP處理MG63細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)1，4，7天，茜素紅進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)的染色。
　　(2).穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒以敲除RAMP1的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（Con-shRNA，shRAMP1

8、）的細(xì)胞用熒光定量PCR、Western blot及免疫熒光染色檢測(cè)RAMP1其他CGRP受體的蛋白和基因水平表達(dá)變化和膜分布的變化。
　　(3).CCK-8法檢測(cè)Con-shRNA組，shRAMP1處理組的細(xì)胞增殖活性。接下來，成骨細(xì)胞的分化也同樣用ALP檢測(cè)。QPCR檢測(cè)成骨細(xì)胞的分化標(biāo)志物Runx2和CollagenⅠ表達(dá)。
　　(4).轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的變化被檢測(cè)。CCK8檢測(cè)加入cAMP/PKA信號(hào)的激動(dòng)

9、劑forskolin后的Con-shRNA組、shRAMP1處理的細(xì)胞的增殖活性。此外，還檢測(cè)了ALP活性以及RUNX2和Collagen ImRNA水平，最后進(jìn)行了各組的茜素紅染色。
　　實(shí)驗(yàn)二
　　(5).首先檢測(cè)了用不同濃度(0-1000ng/ml) LPS作用于MC3T3-E1細(xì)胞48h的細(xì)胞活性。同時(shí)，也檢測(cè)了CGRP的處理對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響。
　　(6).用或無100nm CGRP預(yù)處理MC3

10、T3-E1細(xì)胞30min，再用LPS處理48h，流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)了CGRP對(duì)LPS誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響。與此同時(shí)，還用Western blot檢測(cè)了CGRP對(duì)LPS刺激的Caspase-3剪切蛋白表達(dá)的影響。
　　(7).Western blot檢測(cè)了CGRP對(duì)LPS刺激的ERK信號(hào)活化的影響
　　(8).Micro-CT掃描檢測(cè)牙周炎模型骨破壞程度，BVF值進(jìn)行定量分析骨吸收程度。HE染色檢測(cè)炎性細(xì)胞浸潤

11、;免疫組化染色檢測(cè)牙周組織細(xì)胞凋亡及caspase3剪切和ERK的表達(dá)。
　　總結(jié):
　　(1).CGRP促進(jìn)成骨細(xì)胞的細(xì)胞活性和成骨分化能力。
　　(2).RAMP1的表達(dá)可以抑制CRLR的表達(dá)。
　　(3).敲除RAMP1抑制CGRP誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的活性和成骨分化能力。
　　(4).敲除RAMP1抑制CGRP調(diào)節(jié)的分化是通過cAMP/PKA信號(hào)途徑。
　　(5).CGRP顯著刺激增加成骨細(xì)胞的活力