腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的人護(hù)骨素對(duì)炎癥性關(guān)節(jié)破壞的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種系統(tǒng)性自身免疫病,以進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞為主要特征。大量研究表明破骨細(xì)胞(Osteoclast,OC)在RA的關(guān)節(jié)破壞中發(fā)揮關(guān)鍵作用,在RA滑膜炎階段可以觀察到增生的滑膜或血管翳由骨軟骨移行部向骨組織侵蝕的征象,在其最前線有大量的抗酒石酸酸性磷酸酶和降鈣素受體陽性的多核細(xì)胞即OC的存在。NF-kB受體活化因子配體(Receptor activator ofN

2、F-kB ligand,RANKL)也稱OC分化因子,與破骨前體細(xì)胞或OC表面上的受體RANK結(jié)合,可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和蛋白激酶JNK,從而促進(jìn)OC的增殖、分化、成熟和骨吸收活性。護(hù)骨素(Osteoprotegerin,OPG)屬于TNF受體超家族成員,是RANKL的誘騙(decoy)受體即天然拮抗劑,可阻斷RANKL與RANK的結(jié)合,從而抑制RANKL的生物學(xué)作用。正常骨重建和病理性骨病的發(fā)生均受RANKL與OPG平衡的控制,各

3、種上游因子如1,25(OH)2D3、甲狀旁腺激素、前列腺素、TNFα、IL-1β、IL-6等最終均通過改變RANKL/OPG的比率而發(fā)揮作用。RANKL起破骨作用,而OPG對(duì)骨丟失有保護(hù)作用。目前研究不僅證實(shí)OC及其RANKL/RANK系統(tǒng)參與RA骨關(guān)節(jié)破壞,而且提示外源性增加OPG對(duì)RA關(guān)節(jié)破壞具有潛在的治療價(jià)值。最新的OPG-Fc融合蛋白對(duì)RA的關(guān)節(jié)破壞具有明顯的治療作用,但存在半衰期短,產(chǎn)生抗體等不足,需要多次注射,價(jià)格昂貴,且可

4、產(chǎn)生OPG抗體,影響治療效果。因此探索RA的新治療仍是研究熱點(diǎn)?；蛑委熗ㄟ^誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá),從而體內(nèi)產(chǎn)生治療蛋白,提高有效性和表達(dá)的長期性,可避開這些弊端。 腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)是屬于細(xì)小病毒組的DNA病毒,對(duì)人類沒有致病性。它能有效感染多種細(xì)胞,包括分裂期和靜息期細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞無體內(nèi)免疫反應(yīng),轉(zhuǎn)基因的長期表達(dá)以及病毒粒子的穩(wěn)定性使其成為最有吸引力的轉(zhuǎn)基因工具之一。 本

5、實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了表達(dá)人OPG的復(fù)制缺陷性腺相關(guān)病毒,在體外實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)其具有抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收的活性。通過對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射rAAV-hOPG來觀察OPG對(duì)關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞的保護(hù)作用。 第一部分 攜帶人護(hù)骨素的重組腺相關(guān)病毒(rAAV2-hoPG)的構(gòu)建及滴度測(cè)定 目的：構(gòu)建攜帶人護(hù)骨素的重組腺相關(guān)病毒,并檢測(cè)其滴度。 方法：采用基因工程技術(shù),將hOPG基因片段插入到含AAV2反向末端序列的載體質(zhì)粒p

6、SNAV上,構(gòu)建重組pSNAV2.0-hOPG質(zhì)粒,并用PCR、酶切和測(cè)序鑒定,利用Lipofectamine 2000系統(tǒng)在BHK-21細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行G418選擇培養(yǎng),輔助病毒HSV-rc/△UL2感染后用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行大規(guī)模制備,采用“氯仿處理-PEG/Nacl沉淀氯仿抽提”3個(gè)步驟分離,濃縮和純化rAAV,從而制備高滴度、高純度的腺相關(guān)病毒顆粒。 結(jié)果：酶切鑒定、PCR以及測(cè)序結(jié)果均證明hOPG基因重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建成功,病毒滴

7、度可達(dá)4×1011vg/ml。 結(jié)論：成功制備了高滴度的hOPG基因重組腺相關(guān)病毒2。 第二部分 腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的人護(hù)骨素基因?qū)δz原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)破壞的保護(hù)作用 目的：研究rAAV-OPG對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)破壞的影響。 方法：經(jīng)牛II型膠原誘導(dǎo)建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型,隨機(jī)分成4組：正常對(duì)照組,CIA空白對(duì)照組,EGFP陰性對(duì)照組,OPG治療組,每組10只,于關(guān)節(jié)炎明顯時(shí)開始,分別予PBS、PBS

8、、rAAV-EGFP、rAAV-hOPG雙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射50ul/側(cè)。觀察比較四組大鼠體重,掌跖厚度,關(guān)節(jié)炎指數(shù),病理評(píng)分,X線放射學(xué)評(píng)分,骨破壞因子及炎癥因子表達(dá)。 結(jié)果：預(yù)實(shí)驗(yàn)確定注射病毒載體的最佳轉(zhuǎn)染濃度,冰凍切片證實(shí)AAV能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜及骨髓等組織,ReaITime-PCR證實(shí)病毒感染后,OPG基因轉(zhuǎn)錄水平增高128.21％,TRAP表達(dá)下降了58.79％,對(duì)VEGF表達(dá)無明顯影響。EuSA證實(shí)OPG蛋白的表達(dá)水平升