腺病毒介導(dǎo)的凋亡素對膽管癌作用的研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)的長足發(fā)展，腫瘤的基因治療也取得了明顯的進(jìn)展。一些治療方案已經(jīng)完成了臨床前期的實(shí)驗(yàn)，開始了臨床的探索。但由于還存在諸如缺乏特效目的基因、基因轉(zhuǎn)移的靶向性差、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率還比較低，以及轉(zhuǎn)移基因的體內(nèi)表達(dá)還缺乏有效的調(diào)控手段等問題，基因治療還談不上替代現(xiàn)行的常規(guī)手段。加之惡性腫瘤的發(fā)生是多基因協(xié)同作用、多因素參與和多階段綜合發(fā)展的結(jié)果，只靠矯正一到二種內(nèi)源性基因的突變是很難取得滿意療效的，毒副作用也很難控制。所以人們把目光轉(zhuǎn)向外來

2、物質(zhì)。最近報(bào)道的凋亡素就具有巨大的潛力，它是來源于雞貧血病毒，是該病毒的功能蛋白，能引起雞胸腺細(xì)胞和骨髓成紅細(xì)胞的凋亡。人們將之通過基因手段導(dǎo)入人體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它能引發(fā)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡，而對正常的細(xì)胞無此作用，并且長期表達(dá)于正常細(xì)胞沒有觀察到細(xì)胞轉(zhuǎn)化和死亡。所以我們選擇凋亡素作為研究對象，通過分子生物學(xué)手段將其導(dǎo)入膽管癌細(xì)胞中，觀察它的效用和可能的機(jī)制，并通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)了解它對膽管癌是否具有治療作用，以期探索膽管癌新的治療手段

3、。 本實(shí)驗(yàn)我們通過PCR獲得凋亡素基因，運(yùn)用T4連接酶將它與PGEM-TEasy質(zhì)粒連接，通過測序證實(shí)為全長凋亡素基因后與帶熒光蛋白基因和CMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒連接。然后運(yùn)用Adeasy-1系統(tǒng)構(gòu)建含熒光蛋白基因和凋亡素基因的腺病毒DNA，通過在293細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增后，運(yùn)用氯化銫純化和濃縮后制成高濃度的腺病毒。再用腺病毒感染膽管癌細(xì)胞株，用TUNEL染色了解凋亡素基因是否導(dǎo)致膽管癌細(xì)胞株的凋亡，同時(shí)觀察Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。最后

4、運(yùn)用腺病毒治療裸鼠種植性膽管癌，了解凋亡素是否具有治療作用及相關(guān)副作用。 主要的結(jié)果及結(jié)論如下：1、通過酶切和測序證實(shí)成功構(gòu)建含凋亡素基因的PGEM-TEasy-VP3質(zhì)粒和含熒光蛋白基因及凋亡素基因的Padtrack-CMV-VP3質(zhì)粒。便于永久保存。然后運(yùn)用同源重組機(jī)理在BJ5183細(xì)胞中獲得含凋亡素基因和熒光蛋白基因的腺病毒DNA。利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將重新構(gòu)建的腺病毒DNA導(dǎo)入293細(xì)胞擴(kuò)增。以熒光蛋白作為指示劑，發(fā)現(xiàn)在第7

5、天可大量獲得重組腺病毒，并且證實(shí)了重組腺病毒具有感染能力。利用RT-PCR證實(shí)腺病毒在感染宿主細(xì)胞時(shí)有凋亡素蛋白的編碼，證實(shí)了腺病毒的構(gòu)建成功。利用氯化銫梯度離心純化和濃縮腺病毒，濃度為：6.561×109PFU/ml，為以后的體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2、用構(gòu)建好的腺病毒感染膽管癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)在第4天達(dá)到感染高峰，同時(shí)摸索出膽管癌細(xì)胞株QBC939的最適感染復(fù)數(shù)為65。運(yùn)用TUNEL染色證實(shí)凋亡素能誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞的凋亡。在第7

6、天凋亡率達(dá)到61.9％，足以達(dá)到治療的目的。 3、運(yùn)用WesternBlot檢測重組腺病毒感染膽管癌細(xì)胞株后的Bcl-2蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在第7天的表達(dá)明顯降低，提示凋亡素在誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞株凋亡的后期能導(dǎo)致Bcl-2蛋白的降低，這有助于凋亡素的作用。 4、建立了穩(wěn)定的人膽管癌裸鼠皮下種植瘤模型，采用一次瘤內(nèi)注射重組腺病毒的方式，通過觀察種植瘤體積的變化和利用瘤重計(jì)算抑瘤率，發(fā)現(xiàn)在第六天凋亡素就開始抑制種植性膽管癌的生長，