骨保護(hù)素基因治療抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎軟骨破壞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種病因未明，以反復(fù)發(fā)作的慢性小關(guān)節(jié)炎為主的疾病，其特征為關(guān)節(jié)滑膜增生以及關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨的破壞。導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形、功能喪失以致生活能力下降的主要因素是軟骨和骨的破壞。目前尚無有效抑制該進(jìn)程的方法。
　　在骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中觀察到，骨保護(hù)素(Osteoproegein，OPG)可以有效抑制軟骨和軟骨下骨的破壞。在佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型（Adjuvant-induce

2、darthritis，AIA）中也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)OPG治療的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織得到近乎完全保護(hù)。但是有報(bào)道指出膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)相對(duì)于AIA，其關(guān)節(jié)破壞更明顯，更加接近于RA軟骨的破壞。所以O(shè)PG對(duì)RA關(guān)節(jié)炎軟骨的作用尚需進(jìn)一步研究。而且，OPG抑制關(guān)節(jié)炎軟骨破壞的病理機(jī)制尚未明了。
　　軟骨基質(zhì)主要由纖維狀的膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)和聚集的蛋白聚糖組成。軟骨細(xì)胞是唯一的細(xì)胞成分，負(fù)責(zé)調(diào)

3、節(jié)軟骨的代謝。正常情況下，軟骨細(xì)胞產(chǎn)生軟骨基質(zhì)。分泌多種因子，并在局部達(dá)到平衡，以調(diào)節(jié)軟骨的新陳代謝和軟骨基質(zhì)的平衡。簡(jiǎn)言之，分解代謝因子，如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、3、9、13或解聚素和金屬蛋白酶與血小板反應(yīng)蛋白基序(a disintegrin andmetalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)-4，5可降解軟骨的基質(zhì)，

4、而TIMP-1、2、3、4，IGF-Ⅰ，TGF-β，BMP-2，bFGF等可以促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成，從而抑制MMPs等的作用，進(jìn)而達(dá)到平衡，以保持軟骨的自我更新。超負(fù)荷的壓力或者炎癥因子如IL-1，TNF-α等刺激可能打破軟骨代謝的平衡，從而導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解和破壞。
　　研究顯示RA患者軟骨破壞的主要原因是增生的滑膜和炎癥細(xì)胞的侵蝕，但是至今并無能同時(shí)抑制滑膜炎癥和軟骨破壞的藥物。從軟骨破壞的內(nèi)在機(jī)制，如軟骨細(xì)胞凋亡和蛋白多糖丟失著手

5、進(jìn)一步探索，可能具有重大的臨床意義。Kim等人發(fā)現(xiàn)，在RA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞較非RA患者軟骨細(xì)胞的凋亡率顯著增加。并且凋亡因子caspase3的表達(dá)在RA患者及動(dòng)物模型的軟骨中均明顯增加。此外，通過番紅O染色評(píng)估發(fā)現(xiàn)在CIA模型動(dòng)物中蛋白聚糖丟失更為顯著。表層的蛋白聚糖丟失通常是關(guān)節(jié)軟骨破壞的第一步，在蛋白聚糖的降解中，ADAMTS-4，-5是主要的降解酶。
　　本課題首次對(duì)OPG影響軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)和功能進(jìn)行系統(tǒng)的研究，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與

6、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，在分子生物學(xué)，細(xì)胞學(xué)和病理組織學(xué)水平探索OPG對(duì)軟骨細(xì)胞的影響，并初步探討OPG抑制RA軟骨破壞的機(jī)制:1）體外驗(yàn)證OPG對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖能力的影響;2）探索OPG影響軟骨細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路;3）探討OPG對(duì)軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的影響;4）構(gòu)建攜帶OPG基因的腺病毒，構(gòu)建RA關(guān)節(jié)炎模型CIA;5）評(píng)價(jià)OPG基因治療CIA大鼠后的關(guān)節(jié)軟骨破壞;6)探討軟骨細(xì)胞凋亡在CIA軟骨破壞中的作用以及OPG基因治療對(duì)軟骨細(xì)

7、胞凋亡的影響;7）評(píng)價(jià)OPG基因治療后ADAMTS-5的分泌水平的改變。
　　第一部分骨保護(hù)素對(duì)體外軟骨細(xì)胞增殖及分泌功能的影響
　　目的:
　　體外研究骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)對(duì)軟骨細(xì)胞增殖能力和分泌功能的影響。
　　方法:
　　從1周齡SD大鼠的膝關(guān)節(jié)中，采用膠原酶消化法獲取原代軟骨細(xì)胞。甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用第一代軟骨細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑金(CellCountin

8、g Kit-8，CCK-8)檢測(cè)5，10,20，25，50，100，200 ng/ml濃度OPG對(duì)軟骨細(xì)胞增殖能力的影響。以MEK抑制劑U0126，ERK抑制劑PD098059，P38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理30分鐘，再加入OPG刺激，進(jìn)行CCK-8試驗(yàn)，用以探索OPG對(duì)軟骨細(xì)胞通路的影響。MAPK家族中的三條信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白ERK，P38MAPK和JNK由蛋白質(zhì)免疫印跡法(western-blotting)檢測(cè)刺激后磷酸化

9、水平。定量PCR和western-blotting測(cè)定OPG刺激后軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和組成成分表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:
　　OPG在5-50 ng/ml濃度能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，最佳效應(yīng)濃度為10 ng/ml。U0126，PD098095可以顯著抑制OPG誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖。OPG刺激后15分鐘，軟骨細(xì)胞內(nèi)MEK和ERK蛋白的磷酸化分別增強(qiáng)至0分鐘時(shí)的4.12倍和3.50倍，而P38MAPK和JNK的蛋白磷酸化則無明顯變

10、化。OPG顯著下調(diào)軟骨細(xì)胞ADAMTS-5分泌，上調(diào)TIMP-4的分泌，但對(duì)TIMP-1、2、3，IGF-Ⅰ，TGF-β，bFGF，BMP-2，ADAMTS-4，Collegan-Ⅱ，Aggrecan的表達(dá)無顯著影響。同樣， ERK蛋白抑制后，OPG誘導(dǎo)ADAMTS-5和TIMP-4的表達(dá)改變也被抵消。
　　結(jié)論:
　　OPG通過MEK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。同時(shí)，OPG能下調(diào)ADAMTS-5表達(dá)和上調(diào)TIMP-