基于蜂毒肽的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎基因治療研究.pdf

1、研究背景:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎又稱類風(fēng)濕(Rheumatoid arthritis,RA),是以慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的一種自身免疫性疾病。蜂毒用于治療RA已有近千年的歷史?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》就已有“蜂螯有毒可療疾”的記載。蜂毒味辛、苦,性平,具有活血化瘀、消腫止痛、通經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)散寒的功效。臨床和實驗室資料均證實蜂毒不僅對人類RA有較好的治療作用,對福氏佐劑、II型膠原等引起的RA動物模型也具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛和保護(hù)

2、關(guān)節(jié)軟骨作用。蜂毒成分非常復(fù)雜,含有多種活性肽類。蜂毒肽占蜂毒干重的50％,可能是蜂毒主要活性成分。本次研究擬首先證實蜂毒肽治療RA的療效,然后再以蜂毒肽的編碼基因為治療基因,構(gòu)建蜂毒肽重組AAV進(jìn)行RA基因治療研究,為進(jìn)一步開發(fā)利用蜂毒肽奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分:探索蜂毒肽對RA模型動物患關(guān)節(jié)的保護(hù)效果研究
　　目的:觀察蜂毒肽對RA模型動物患關(guān)節(jié)的保護(hù)效果。
　　研究方法:雄性SD大鼠60只,隨機分為蜂毒組(Bv)

3、、蜂毒肽組(Me)、鹽水對照組(Mn)和假模型組(Nn)。前三組在右后足掌部向足尖注射完全福氏佐劑誘導(dǎo)RA模型,之后于患側(cè)足三里分別注射蜂毒(1mg/kg)、蜂毒肽(0.5mg/kg)、生理鹽水(10ul)和生理鹽水(10ul)治療,三周后實驗結(jié)束。每周測量體重一次,每周測量關(guān)節(jié)厚度一次;每3天檢測縮足逃避反射時間一次。造模后7天進(jìn)行Fos免疫組化檢測;實驗結(jié)束后拍攝正位片和側(cè)位片觀察治療前后骨關(guān)節(jié)X光改善情況,ELISA測定關(guān)節(jié)勻漿I

4、L-10、TNF-α含量。
　　研究結(jié)果:各組大鼠體重都隨著時間的而增加,差異都無統(tǒng)計學(xué)意義。注射完全福氏佐劑4天后患側(cè)關(guān)節(jié)均出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹,而非模型組無明顯變化。觀察至第12天時Me組(0.73±0.09cm)、Bv組(0.75±0.07cm)關(guān)節(jié)厚度明顯低于Mn組(0.99±0.06cm),方差分析顯示差異顯著(P＜0.05)。這一趨勢一直持續(xù)至實驗結(jié)束。實驗開始時,各組縮足逃避反射時間在基本一致;但在造模后的第一次觀察(第6天

5、)就可以發(fā)現(xiàn)Me(9.5±0.5S)、Bv(10.6±0.6S)、Nn(9.8±0.8S)的縮足逃避反射時間都高于Mn組(6.3±0.6S),方差分析顯示差異顯著(P＜0.05)。這一趨勢一直持續(xù)至實驗結(jié)束。Bv、Me、Mn、Nn組淺層的Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)目分別為37±6個、34±5個、56±8個、35±4個,經(jīng)過方差分析顯示Bv、Me、Nn組淺層的Fos陽性神經(jīng)元數(shù)目差異無顯著性,但與Mn組差異顯著(P＜0.05)。蜂毒肽及蜂毒治療

6、可以改善足掌關(guān)節(jié)X光表現(xiàn),抑制患側(cè)關(guān)節(jié)腔TNF-α分泌,提高患側(cè)關(guān)節(jié)IL-10含量,方差分析顯示差異顯著(P＜0.05)。蜂毒及蜂毒肽治療對健側(cè)足掌關(guān)節(jié)厚度、縮足逃避反射時間、關(guān)節(jié)細(xì)胞因子的含量均無影響。
　　研究結(jié)論:1.通過比較蜂毒肽與蜂毒治療RA效果的全面比較,證實蜂毒肽是蜂毒治療RA的活性成分;2.蜂毒肽可以抑制RA關(guān)節(jié)的Th1類細(xì)胞因子的表達(dá),增強Th2類細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　第二部分:蜂毒肽重組腺相關(guān)病毒及其體外

7、鑒定研究
　　目的:構(gòu)建蜂毒肽重組腺相關(guān)病毒及其體外鑒定。
　　實驗方法:采用化學(xué)合成法合成含有26個氨基酸的蜂毒肽基因序列,其中含5‘PmacI酶切點,3’含終止子及BamHI酶切點,Klenow片段補平,連接入T載體,酶切測序鑒定。PmacI、BamHI雙酶切表達(dá)盒T載體pGEM-T Easy/NT4,回收大片段,與含有Mel-cDNA序列的PmacI、BamHI雙酶切產(chǎn)物連接,酶切鑒定后再用EcoRI與BamHI聯(lián)合酶

8、切,回收小片段,插入rAAV載體pSSCMV,與pAAV-Ad及pFG140三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,雜交法滴定病毒滴度。體外轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞,免疫組化測定體外蜂毒肽表達(dá)情況。
　　實驗結(jié)果:經(jīng)過電泳、酶切和測序證實T載體內(nèi)Mel-cDNA序列及導(dǎo)入的酶切位點插入正確;pGEM-T Easy/NT4與Mel-cDNA序列及其酶切位點連接正確;表達(dá)盒正確插入了rAAV載體pSSCMV;rAAV/Mel經(jīng)檢測滴度達(dá)到1012/ml。體外

9、感染實驗證實rAAV/Mel可以分泌表達(dá)蜂毒肽。
　　研究結(jié)論:1.獲取了蜂毒肽的基因,構(gòu)建了EcoRI-NT4-NaeI-TAT-6His-PmaCI- Mel-BamHI表達(dá)盒;2.成功構(gòu)建了rAAV/Mel,并可體外分泌蜂毒肽。
　　第三部分:蜂毒肽重組腺相關(guān)病毒抗風(fēng)濕作用研究研究
　　目的:探討蜂毒肽重組腺相關(guān)病毒的抗風(fēng)濕作用。
　　實驗方法:完全弗氏佐劑誘導(dǎo)大鼠右后足掌關(guān)節(jié)RA模型,分別在患側(cè)足三里給與

10、蜂毒肽、rAAV/Mel、rAAV/GFP進(jìn)行治療;同時在患側(cè)關(guān)節(jié)皮下、同側(cè)臀大肌、對側(cè)足三里注射rAAV/Mel,探討不同注射部位對療效的影響。定期稱量體重,足掌關(guān)節(jié)厚度和縮足逃避反射時間。實驗結(jié)束后拍攝正位片和側(cè)位片觀察治療前后骨關(guān)節(jié)X光改善情況。ELISA檢測關(guān)節(jié)勻漿TNF-α、IL-10含量。
　　實驗結(jié)果:注射完全福氏佐劑4天后患側(cè)關(guān)節(jié)均出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹,觀察至第12天時Me組(0.75±0.07cm)、RMZ組(0.72±

11、0.09cm)、RMZ(0.72±0.04cm)、RMT(0.71±0.04cm)、RMP(0.65±0.06cm),關(guān)節(jié)厚度明顯低于RMD組(0.97±0.05cm)和RC組(0.94±0.04cm),方差分析顯示差異顯著(P＜0.05),這一趨勢一直持續(xù)至實驗結(jié)束。各組縮足逃避反射時間在實驗開始時基本一致,但在造模后的第一次觀察(第6天)就發(fā)現(xiàn)Me組(10.4±1.1S)、RMZ組(9.7±1.5S)、RMP組(9.8±1.3S)、

12、RMT組(9.6±0.8S)的縮足逃避反射時間都高于RMD組(6.2±1.2S),方差分析顯示差異顯著(P＜0.05),這一趨勢一直持續(xù)至實驗結(jié)束。蜂毒肽及重組蜂毒肽治療可以抑制患側(cè)TNF-α分泌, RC、RMD組患側(cè)關(guān)節(jié)勻漿TNF-α含量分別為270.5±23.1pg/ml、328.2±67.3pg/ml高于Me組(78.7±39.2pg/ml)、RMZ組(78.3±29.7pg/ml)、RMT組(62.3±34.5pg/ml)和RM

13、P組(68.1±32.5pg/ml),方差分析顯示差異顯著(P＜0.05),而對健側(cè)關(guān)節(jié)TNF-α含量無影響?；紓?cè)足掌關(guān)節(jié)和對側(cè)足掌關(guān)節(jié)勻漿經(jīng)EILSA檢測發(fā)現(xiàn)RC、RMD患側(cè)關(guān)節(jié)勻漿分別為21±8.1pg/ml、24±6.3pg/ml,而Me、RMZ、RMT、RMP組IL-10含量分別為51.2±7.1pg/ml、53.4±8.0pg/ml、49.8±7.1pg/ml、48.2±7.9pg/ml,方差分析顯示RC、RMD患側(cè)關(guān)節(jié)勻漿I

14、L-10含量低于RMZ、RMT、RMP組,差異顯著(P＜0.05)。提示rAAV/Mel可以促進(jìn)患側(cè)關(guān)節(jié)腔分泌IL-10,且與注射位置有關(guān)系。健側(cè)關(guān)節(jié)勻漿IL-10含量經(jīng)過方差分析檢驗差異無顯著性。Me、RMZ、RMT、RMP組足掌關(guān)節(jié)X光表現(xiàn)也優(yōu)于RC、RMD組。各組體重在各個時間點的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)論:1.明確了基于蜂毒肽開展RA基因治療的療效;2.基因治療的療效與給藥位置可能有關(guān);3.從TNF、IL-10水平