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文檔簡介
1、背景:
前列腺癌是男性常見惡性腫瘤,而且極易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。此前有研究提示肝細(xì)胞生長因子Kringle 1結(jié)構(gòu)域(HGFK1)基因能夠明顯抑制腫瘤血管生成,同時能夠阻斷表皮生長因子(EGF)對于表皮生長因子受體(EGFR)的激活作用。
目的:
(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察肝細(xì)胞生長因子Kringle 1結(jié)構(gòu)域(HGFK1)基因?qū)θ饲傲邢侔┞闶竺劰枪撬枨粌?nèi)移植瘤生長及轉(zhuǎn)移的治療作用,并初步探討其相關(guān)機(jī)制。
2、> (2)體外實(shí)驗(yàn)觀察肝細(xì)胞生長因子Kringle 1結(jié)構(gòu)域(HGFK1)基因?qū)θ饲傲邢侔┘?xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的治療情況,并初步探討其相關(guān)機(jī)制。
方法:
一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法
(1)構(gòu)建攜帶有HGFK1基因和增強(qiáng)型綠色螢光蛋白基因(EGFP)的腺相關(guān)病毒載體(rAAV- HGFK1,rAAV-EGFP)。
(2)通過向裸鼠脛骨骨髓腔內(nèi)注射人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞懸液建立
3、人前列腺癌裸鼠骨移植瘤模型。
(3)通過向瘤內(nèi)和尾靜脈內(nèi)注射PBS、rAAV-EGFP或rAAV-HGFK1分別治療荷瘤裸鼠。
(4)觀察三個治療組的裸鼠人前列癌骨移植瘤模型的腫瘤生長情況、生存時間、腫瘤內(nèi)血管密度及轉(zhuǎn)移情況。
(5)免疫組化方法觀察三組裸鼠腫瘤組織增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)的變化。
二、體外實(shí)驗(yàn)方法
(1)腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染情況觀察:rAAV-EGFP轉(zhuǎn)染PC3
4、細(xì)胞后,在熒光顯微鏡下觀察PC3細(xì)胞內(nèi)綠色螢光蛋白的表達(dá)情況。計算轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率。RT-PCR法測定rAAV-HGFK1轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞后HGFK1的表達(dá)情況。
(2)細(xì)胞增殖情況觀察: CCK8法(WST-8法)觀察PBS、rAAV-EGFP及rAAV-HGFK1治療后,前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞生長曲線的變化情況。
(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況觀察:傷口愈合實(shí)驗(yàn)觀察PBS、rAAV-EGFP及rAAV-HGFK1治療后,
5、前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞遷移能力的變化情況。Transwell實(shí)驗(yàn)觀察PBS、rAAV-EGFP及rAAV-HGFK1治療后,前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞侵襲能力的變化情況。 (4)轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制的初步研究:RT-PCR方法了解PBS、rAAV-EGFP及rAAV-HGFK1治療后,轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的變化情況。
結(jié)果:
一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1) 移植瘤種植情況觀察:左下肢脛骨平臺處注射PC3細(xì)胞4周后,經(jīng)病理組織學(xué)檢
6、查確認(rèn)全部成瘤。
(2) 腫瘤生長情況觀察:導(dǎo)入的HGFK1基因?qū)δ[瘤生長有明顯的抑制作用,抑瘤率達(dá)46.69%。
(3)裸鼠生存時間觀察:裸鼠的生存時間明顯延長,PBS和rAAV-EGFP對照組中位生存時間分別為47 天和49天,而rAAV-HGFK1治療組的中位生存時間為 68天。rAAV-HGFK1治療組與兩對照組之間的差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
(4)轉(zhuǎn)移情況觀察:在對照的
7、PBS注射組和rAAV-EGFP注射組,腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率均是100%。而治療組卻僅有20%。rAAV-HGFK1治療組與兩對照組之間的差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
(5)病理組織學(xué)觀察:光鏡下的觀察證實(shí)了rAAV-HGFK1對腫瘤細(xì)胞增值、轉(zhuǎn)移以及腫瘤內(nèi)血管生成的抑制作用。
一、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(1) 腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞情況觀察:PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV-EGFP72小時后,
8、綠色螢光蛋白的表達(dá)率為:39%,rAAV-HGFK1轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞72小時后,RT-PCR法觀察發(fā)現(xiàn),HGFK1mRNA明顯表達(dá)。
(2) PC3細(xì)胞增殖情況觀察:生長曲線觀察發(fā)現(xiàn)rAAV-HGFK1治療組PC3細(xì)胞增殖較PBS組及rAAV-HGFK1治療組顯著減慢。
(3) PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力觀察:傷口劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)rAAV-HGFK1治療組PC3細(xì)胞遷移侵襲能力較PBS組及rAA
9、V-HGFK1治療組顯著降低。
(4)PC3細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的觀察:RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)rAAV-HGFK1治療組尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(urokinase type plasminogen activator,uPA)及甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(Parathyroid hormone-related protein,PTHrP) mRNA水平的表達(dá)較PBS組及rAAV-HGFK1治療組顯著降低。
結(jié)論
10、:
(1)HGFK1在體內(nèi)及體外均明顯地抑制了骨髓微環(huán)境內(nèi)前列腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力,體內(nèi)腫瘤血管生長也受到了明顯的抑制。
(2)荷瘤裸鼠的生存時間顯著延長。
(3)HGFK1治療使得PC3細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)分子uPA及PTHrP mRNA水平的表達(dá)顯著降低,提示HGFK1在體內(nèi)及體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出來的轉(zhuǎn)移抑制作用可能與此二者的表達(dá)受抑制有關(guān)。
(4)該研究提示HGFK1為前列腺癌
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