人前列腺癌裸鼠模型的建立和應(yīng)用.pdf

1、前列腺癌是歐美國(guó)家最常見的一種男性惡性腫瘤，近年來(lái)在我國(guó)該病的發(fā)病率也有明顯上升趨勢(shì)。臨床上40％的前列腺癌病人，在初診時(shí)或長(zhǎng)期隨診后，會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移癥狀。要能了解前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并有效設(shè)計(jì)合理的治療策略，首先要能建立能反應(yīng)臨床前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的人前列腺癌研究模型。而目前我國(guó)已有的前列腺癌模型較少，尤其是關(guān)于原位前列腺癌模型方法更少，同時(shí)在分子水平上探討比卡魯胺治療前列腺癌的文章較少，因而系統(tǒng)建立各種前列腺癌模型并且比較他

2、們的差異，同時(shí)從分子水平上研究比卡魯胺對(duì)前列腺癌的作用，對(duì)于研究前列腺癌發(fā)生、發(fā)展轉(zhuǎn)移機(jī)制及開發(fā)新型抗前列腺癌藥物具有重大意義。 目的： 研究比卡魯胺對(duì)裸鼠移植前列腺癌的藥效作用并探討比卡魯胺治療前列腺癌的機(jī)制，同時(shí)建立多種前列腺癌皮下和原位模型。 方法： 1．對(duì)四種前列腺癌細(xì)胞(PC-3M、DU145、LNCaP和CWR22R-v1)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分別注射入裸小鼠右側(cè)皮下，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況并測(cè)量腫瘤體積

3、，繪制生長(zhǎng)曲線。同時(shí)系統(tǒng)比較DU145細(xì)胞和CWR22Rv1細(xì)胞皮下和原位移植后成瘤率、瘤重指數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和生長(zhǎng)曲線等。 2．我們分別采取CWR22Rv1細(xì)胞原位注射法、組織塊包埋法、組織塊懸掛法建立前列腺癌原位模型，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況并在裸鼠瀕臨死亡時(shí)處死裸鼠，測(cè)量腫瘤體積并稱瘤重，同時(shí)肉眼觀察淋巴結(jié)及臟器轉(zhuǎn)移情況。同時(shí)腫瘤、臟器和周圍淋巴結(jié)固定做病理觀察。 3．采用皮下組織塊移植法建立裸小鼠前列腺癌模型，每4d觀察

4、裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠腫瘤的最長(zhǎng)徑和最短徑，按照公式V=0.5ab<'2>計(jì)算腫瘤體積，式中V為腫瘤體積，a 為通過腫瘤中心量取的最長(zhǎng)徑，b為通過腫瘤中心量取的最短徑。直至所有裸鼠腫瘤體積范圍為100mm<'3>～300mm<'3>，隨機(jī)分成4組：陰性對(duì)照組、比卡魯胺1mg/kg、5mg/kg和 25mg/kg劑量組，每組8只，開始按10ml/kg 的體積灌胃給藥。連續(xù)給藥30d；裸鼠體重每4d稱一次，且用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸

5、鼠長(zhǎng)短徑，計(jì)算腫瘤體積并繪制生長(zhǎng)曲線。停藥24小時(shí)后處死所有裸鼠，稱量裸鼠體重，取出皮下腫瘤，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑，稱腫瘤體重，計(jì)算抑瘤率。 4．解剖時(shí)，福爾馬林固定腫瘤組織、重要臟器及淋巴結(jié)，切片，免疫組化SP法測(cè)定各組動(dòng)物腫瘤的雄激素受體(AR)和增值細(xì)胞核抗原(PCNA) 的表達(dá)，了解比卡魯胺對(duì)裸鼠前列腺癌AR及PCNA表達(dá)的影響。 5．解剖時(shí)，各組裸鼠中取部分腫瘤迅速投入液氮罐中保存。選取比卡魯胺高劑量組腫瘤和對(duì)照組腫

6、瘤，用基因芯片法，尋求差異表達(dá)基因，并用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法對(duì)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，了解比卡魯胺體內(nèi)對(duì)裸鼠前列腺癌在前列腺癌生物標(biāo)記相關(guān)基因表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1．本實(shí)驗(yàn)表明各模型在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)速度為：CWR22Rv1細(xì)胞>PC-3M 細(xì)胞>DU145細(xì)胞>LNCaP細(xì)胞。無(wú)論是采取原位接種還是皮下接種法接種DU145細(xì)胞和CWR22Rv1細(xì)胞，裸鼠成瘤率都達(dá)到10/10，就腫瘤重量而言，皮下接種法所形成腫瘤要明顯大于原

7、位接種法。就局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來(lái)說(shuō)，原位接種法產(chǎn)生轉(zhuǎn)移主要部位是腹腔內(nèi)淋巴結(jié)(主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)為主)，頸背部皮下接種法主要向腋窩、頸部等部位轉(zhuǎn)移。采用原位接種法CWR22Rv1細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為9/10，而同樣的方法接種DU145細(xì)胞只產(chǎn)生1/lO的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。而采用皮下接種法兩種細(xì)胞均未檢測(cè)到任何淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。 2．三種方法均成功的建立了前列腺癌原位轉(zhuǎn)移模型。其中細(xì)胞接種法接種后14d可于下腹前列腺部觸及結(jié)節(jié)。48d后10只C

8、WR22Rv1組裸鼠都出現(xiàn)惡液質(zhì)。10只CWR22Rv1移植裸鼠中有9只裸鼠腹主動(dòng)脈旁均可見腫大的淋巴結(jié)，直徑約2mm，病理證實(shí)轉(zhuǎn)移。而包埋法接種后5d可于下腹前列腺部觸及結(jié)節(jié)。25d后10只裸鼠都出現(xiàn)惡液質(zhì)，腫瘤平均重量(2910±350)g。而懸掛法接種后3d可于下腹前列腺部觸及結(jié)節(jié)，23d后10只裸鼠都出現(xiàn)惡液質(zhì)，腫瘤平均重量(4302±390)g。10只裸鼠均發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)。 3．接種后，成瘤率為100％；接種后第8

9、d，32 只裸鼠皮下腫瘤體積均在100mm<'3>～300mm<'3>之間。到給藥30d后，比卡魯胺低劑量組、中劑量組和高劑量組的腫瘤體積明顯小于陰性對(duì)照組(P<0.01)，瘤重量也低于對(duì)照組(P<0.01)，抑瘤率分別為10.77％、37.32％和63.28％。 4．免疫組化結(jié)果表明比卡魯胺高劑量組中PCNA 的表達(dá)量遠(yuǎn)低于對(duì)照組(P<0.05)，AR 表達(dá)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組(P<0.05)。 5．基因芯片技術(shù)檢測(cè)了比

10、卡魯胺高劑量組和對(duì)照組腫瘤在263個(gè)前列腺癌生物標(biāo)記基因的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有八種基因在比卡魯胺高劑量組腫瘤中表達(dá)水平與對(duì)照組的腫瘤表達(dá)有明顯差異。為驗(yàn)證該結(jié)果的可靠性，我們使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR 技術(shù)對(duì)其中三種差異性表達(dá)的基因在兩種細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果與基因芯片結(jié)果基本一致。 結(jié)論： 1.PC-3M、DU145、CWR22Rv1、LNCaP 細(xì)胞接種到裸小鼠皮下均可建立前列腺癌動(dòng)物模型。LNCaP細(xì)胞加入M

11、atrigel膠后才能形成前列腺癌皮下模型。CWR22Rv1 細(xì)胞原位接種法能獲得9/10淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，高于DU145細(xì)胞(1/10)。 2．細(xì)胞注射法、組織包埋法和懸掛法都成功建立前列腺癌原位模型，成瘤率為100％。組織塊包埋法人為腹腔轉(zhuǎn)移少，是比較理想的方法。組織懸掛塊和細(xì)胞原位接種法較易導(dǎo)致人為腹腔轉(zhuǎn)移。 3．比卡魯胺高劑量組腫瘤重量低于對(duì)照組(P<0．01)，抑瘤率>40％。認(rèn)為比卡魯胺高劑量組對(duì)CwR22Rv1

12、 細(xì)胞裸鼠前列腺癌有治療作用。比卡魯胺高劑量組能顯著降低PCNA和AR的表達(dá)(相對(duì)于陰性對(duì)照組)。 4．在體內(nèi)，比卡魯胺能夠下調(diào)八種前列腺癌相關(guān)基因的表達(dá)。這些基因大部分已公認(rèn)與前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。提示比卡魯胺可能通過降低裸鼠移植前列腺癌這些相關(guān)基因的表達(dá)，從而降低前列腺癌的種植能力、侵襲性，改變其生物學(xué)特質(zhì)和行為，達(dá)到抑制前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展的目的。 5．這些結(jié)果再次證實(shí)了“種子與土壤”學(xué)說(shuō)，并且成功用 4