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1、牙周炎及根尖周炎等口腔感染性疾病影響了超過(guò)80%的成年人群。其病程中,病原體引起口腔局部炎癥,刺激破骨細(xì)胞分化和活動(dòng),最終可導(dǎo)致牙槽骨喪失,牙齒松動(dòng),甚至牙齒缺失。近年來(lái)有研究表明,Ac45基因可作為溶骨性疾病的新型治療靶點(diǎn),而且該基因?qū)植棵庖邞?yīng)答也可能有一定影響。腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)介導(dǎo)的RNA干擾是目前新穎有效的一種基因治療手段,治療后免疫反應(yīng)輕微,安全性高。該研究采用攜帶短發(fā)夾RNA
2、的腺相關(guān)病毒作為載體,構(gòu)建以Ac45為靶點(diǎn)的shRNA腺相關(guān)病毒(AAV-sh-Ac45),特異性下調(diào)Ac45表達(dá),研究其在牙周炎,根尖周炎中的牙槽骨保護(hù)作用及對(duì)局部炎癥免疫反應(yīng)的影響,并初步探討其作為牙周炎和根尖周炎一種新的基因治療的潛力。
目的:構(gòu)建下調(diào)Ac45表達(dá)的AAV-sh-Ac45,通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn),采用完善建立的牙周炎及根尖周炎小鼠模型,研究其對(duì)牙槽骨吸收和局部炎癥免疫反應(yīng)的影響,為建立牙周炎及根尖周炎的基因治
3、療新方法提供依據(jù)。
方法:⑴構(gòu)建以AAV為載體,特異性靶向Ac45的shRNA,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞,通過(guò)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,吖啶橙染色和F-肌動(dòng)蛋白環(huán)染色檢測(cè)破骨細(xì)胞的分化和酸化,通過(guò)麥胚凝集素染色和掃描電鏡檢測(cè)骨吸收情況。⑵通過(guò)小鼠口腔給菌,建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型,各組小鼠分別給予AAV-sh-Ac45和AAV-sh-luc-YFP(陽(yáng)性對(duì)照),并用正常未給菌小鼠作為陰性對(duì)照。第56天處死動(dòng)物,收集牙槽骨樣
4、本。通過(guò)亞甲基藍(lán)染色和HE染色檢測(cè)牙周骨質(zhì)吸收情況。對(duì)樣本進(jìn)行TRAP染色,免疫組化和免疫熒光染色,研究AAV-sh-Ac45對(duì)破骨細(xì)胞數(shù)量和功能,以及對(duì)Ac45,Cath K,CD3,F(xiàn)4/80等的表達(dá)的影響。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定進(jìn)行IL-1α,IL-6,IL-10,IL-12,IL-17A和TNF-α的表達(dá)水平的檢測(cè)。實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒?Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)應(yīng)用于分析Cath K,RA
5、NKL,OPG,TNF噸,IL-1α,IL-6和IL-17A的表達(dá)水平。⑶小鼠下頜第一磨牙開(kāi)髓,疏通根管并感染細(xì)菌以建立根尖周炎模型,各組小鼠分別給予AAV-sh-Ac45和AAV-sh-luc-YFP,并用正常未開(kāi)髓小鼠作為陰性對(duì)照。手術(shù)后第42天處死動(dòng)物。采用Micro CT及HE染色分析根尖周病變特征及病灶區(qū)域大小。采用免疫組化和免疫熒光染色檢測(cè)Ac45表達(dá)及相關(guān)免疫反應(yīng)。提取根尖周炎病變的總RNA和蛋白質(zhì),檢測(cè)炎性因子以及破骨細(xì)
6、胞相關(guān)基因水平的變化。
結(jié)果:①在體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞內(nèi)通過(guò)AAV介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)顯著下調(diào)了Ac45表達(dá),破骨細(xì)胞分化和酸化功能受到抑制,骨吸收顯著降低。②在細(xì)菌誘導(dǎo)的小鼠牙周炎模型中,AAV-sh-Ac45有效感染牙周組織并下調(diào)Ac45表達(dá),抑制了牙槽骨吸收,牙周組織內(nèi)單核細(xì)胞浸潤(rùn)減少,樹(shù)突狀細(xì)胞,T細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞顯著減少,局部炎癥反應(yīng)得到抑制。牙周組織局部破骨細(xì)胞相關(guān)基因和促炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平也顯著降低。③在
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