Nrf2在根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建中作用的初步研究.pdf

1、根尖周炎是一種多由微生物感染引起的發(fā)生在牙根尖周組織的炎癥性疾病。臨床上，對于發(fā)生根尖周炎的牙齒，需進(jìn)行根管治療，而年輕恒牙治療方法還包括氫氧化鈣根尖誘導(dǎo)成形術(shù)和現(xiàn)在臨床上較常用的MTA根尖屏障術(shù)。但根尖誘導(dǎo)成形術(shù)時間和效果不確定，根尖屏障術(shù)雖然可以提高患者的依從性，提高了治愈的概率，但很難使牙根得到完全發(fā)育。短而薄弱的牙根會增加后續(xù)折裂的可能性。年輕恒牙根尖周炎的治療，預(yù)期達(dá)到的結(jié)果應(yīng)包括治愈根尖周炎癥、促進(jìn)牙根的繼續(xù)發(fā)育及牙髓組織的

2、功能性（組織學(xué)和感覺）修復(fù)的完成。然而目前治療方案很難達(dá)到這一目標(biāo)，僅能在治愈根尖周炎癥這一方面有所保障。臨床研究和一系列病例報道均表明，牙髓壞死伴根尖周炎的年輕恒牙經(jīng)過嚴(yán)格根管消毒、刺激根尖周血液進(jìn)入根管和嚴(yán)密冠部充填，可能夠使得牙根繼續(xù)發(fā)育，X線表現(xiàn)為牙根長度增加、根管壁增厚、根尖孔逐漸閉合以及根尖病變消失，這一治療方法稱為“牙髓血運(yùn)重建”(pulp revascularization)。
　　根尖周病的發(fā)生、發(fā)展以及牙髓血運(yùn)

3、重建的過程是多重因素交互作用，機(jī)制非常復(fù)雜的過程，對其機(jī)制存在許多假設(shè)尚未形成成熟的理論，有待進(jìn)一步研究。研究根尖周炎的發(fā)病機(jī)制，尤其是各種細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子在根尖周炎中的作用，一直以來都是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。
　　轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor2，Nrf2)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，以Keap1-Nrf2-ARE信號通路介導(dǎo)Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，被認(rèn)為是迄今為止細(xì)胞抗氧

4、化機(jī)制中發(fā)現(xiàn)的最重要的通路。許多疾病的發(fā)生都與氧化應(yīng)激相關(guān)，Keap1-Nrf2-ARE通路的抗氧化作用廣泛，可以保護(hù)多種細(xì)胞，在許多疾病中起到重要作用，其中包括惡性腫瘤、帕金森病、阿爾茨海默病、糖尿病等。
　　近年來發(fā)現(xiàn)其在炎癥的抑制中也能起到重要作用。研究表明Keap1-Nrf2-ARE信號通路參與削弱炎癥相關(guān)病理過程。此外，Nrf2還有促血管形成的功能。研究表明，Nrf2與血管的形成修復(fù)、血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)、增殖、分化、遷移

5、以及血管形成能力相關(guān)。Nrf2與口腔疾病相關(guān)的研究較少。近年來學(xué)者研究表明Keap1-Nrf2-ARE通路的激活可能抑制牙齦卟啉單胞菌LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)及結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠牙周炎的發(fā)展等。根尖周炎的發(fā)生發(fā)展是炎癥相關(guān)病理過程，牙髓血運(yùn)重建過程，是一個在炎癥控制的條件下根管內(nèi)新生組織長入的過程，而新生組織的生存離不開血運(yùn)的重建，故推測Nrf2在根尖周炎的發(fā)展以及牙髓血運(yùn)重建過程也可能起到一定作用。
　　綜上所述，Nrf2是一種

6、在細(xì)胞保護(hù)、炎癥控制及血管形成中均有可能起到重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，但由于倫理道德上存在局限性，在人體內(nèi)難以檢測其在根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建過程中的動態(tài)表達(dá)過程。本實驗選擇小鼠作為實驗對象，測定Nrf2在炎癥及組織愈合過程中分布及表達(dá)量隨時間變化的規(guī)律，為探索根尖周炎愈合及牙髓血運(yùn)重建的機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。
　　目的：
　　本實驗擬通過建立小鼠根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建模型，研究Nrf2在根尖周炎發(fā)展及牙髓血運(yùn)重建組織新生過程中的

7、影響，為研究根尖周炎發(fā)生發(fā)展及牙髓血運(yùn)重建機(jī)制提供一定理論依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分 小鼠下頜第一磨牙根尖周炎模型的建立
　　20只3周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)選取10只作為實驗組，另外10只作為對照組。實驗組小鼠下頜第一磨牙從冠部開髓，髓腔開放于口腔環(huán)境3周。于術(shù)后3周處死實驗動物，分離下頜骨，進(jìn)一步進(jìn)行組織學(xué)、影像學(xué)及熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測。5只實驗動物脫頸處死，分離下頜骨，固定24 h，使用M

8、icro-CT成像系統(tǒng)對標(biāo)本逐個進(jìn)行斷層掃描成像，用于后續(xù)觀察分析。掃描過后標(biāo)本制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色。將實驗組另外5只小鼠脫頸處死，提取根尖周及根管內(nèi)組織總RNA，qRT-PCR檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)情況，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　第二部分 小鼠下頜第一磨牙牙髓血運(yùn)重建模型的建立
　　30只3周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)選取20只作為實驗組（10只使用流動樹脂行冠部充填，10使用玻璃

9、離子水門汀行冠部充填），另外10只作為對照組。實驗組小鼠下頜第一磨牙從冠部開髓，使用6#、8#K銼疏通根管，去除牙髓，并將K銼超出根尖孔，刺激根尖周組織出血至根管口水平，待血凝塊形成后，使用MTA覆蓋整個血凝塊面。其中10只小鼠使用玻璃離子水門汀(GIC)進(jìn)行冠部充填，另外10只小鼠使用流動樹脂進(jìn)行冠部充填，記錄手術(shù)時間。術(shù)后3周檢查牙髓血運(yùn)重建組充填物脫落情況，對兩組手術(shù)時間及充填物脫落率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。處死實驗動物，分離下頜骨，同實

10、驗一方法進(jìn)一步進(jìn)行組織學(xué)、影像學(xué)分析及qRT-PCR檢測VEGF mRNA表達(dá)情況。
　　第三部分 Nrf2在根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建過程中表達(dá)的研究
　　10只3周齡C57BL/6小鼠進(jìn)行脫頸處死，分離下頜骨，置于4％中性多聚甲醛中固定24 h，使用防脫片制作石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，檢測Nrf2表達(dá)情況。20只小鼠，左側(cè)下頜第一磨牙行牙髓血運(yùn)重建術(shù)，右側(cè)下頜第一磨牙將牙髓腔直接開放于口腔環(huán)境3周，造成實驗性根尖周炎。于術(shù)后

11、1、4周處死實驗動物，分離下頜骨，進(jìn)一步進(jìn)行HE染色、影像學(xué)掃描。提取組織總RNA，根尖周炎組qRT-PCR檢測Nrf2、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)情況，牙髓血運(yùn)重建組檢測Nrf2、VEGF mRNA表達(dá)情況，未經(jīng)處理的小鼠作為對照組，檢測以上所有因子。根尖周炎組及牙髓血運(yùn)重建組各時間點分別選取與HE染色結(jié)果連續(xù)的切片進(jìn)行免疫組化染色，觀察Nrf2表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.建立小鼠下頜第一磨牙根尖周

12、炎模型
　　實驗期間動物一般狀況良好，未觀察到明顯牙體折裂或松動。Micro-CT顯示，術(shù)后3周根尖周炎組下頜第一磨牙可觀察到根尖周骨質(zhì)破壞。組織學(xué)結(jié)果表明，根管內(nèi)充滿壞死物質(zhì)，根尖周大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等慢性炎癥細(xì)胞浸潤，IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)顯著高于對照組(P＜0.05)。
　　2.建立小鼠下頜第一磨牙牙髓血運(yùn)重建模型
　　術(shù)后3周，牙髓血運(yùn)重建組部分牙冠部充填物脫落。與流動樹

13、脂組相比，玻璃離子水門汀組手術(shù)耗時較少，且充填物脫落率低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。Micro-CT顯示，牙髓血運(yùn)重建組下頜第一磨牙牙冠可見高密度充填物影像，封閉根管口，根管腔縮窄，管壁增厚，根尖部膨大，有新生硬組織形成，根尖孔縮小。組織學(xué)分析表明，管腔有血管化的新生組織長入，根尖部有骨樣及軟骨樣組織沉積，VEGF mRNA表達(dá)顯著高于對照組(P＜0.05)。
　　3.Nrf2在根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建過程中表達(dá)的變化<

14、br>　　正常情況下，Nrf2在牙髓及根尖周組織中表達(dá)較少，表達(dá)部位主要在胞漿。與對照組相比，實驗組各時間點Nrf2陽性細(xì)胞都有所增加，胞漿與胞核都存在Nff2表達(dá)，且胞核Nrf2表達(dá)大大增加。根尖周炎組中術(shù)后1周Nrf2陽性細(xì)胞多于術(shù)后4周，根管內(nèi)及根尖周炎癥區(qū)域可見Nrf2呈陽性表達(dá)，主要位于淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞中，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞漿或胞核呈棕黃色深染，根管內(nèi)成纖維細(xì)胞也可見Nrf2陽性表達(dá)。牙髓血運(yùn)重建組中術(shù)后4周

15、Nrf2陽性細(xì)胞多于術(shù)后1周，可見根管內(nèi)及根尖周組織Nrf2呈陽性表達(dá)，主要為形狀不規(guī)則的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗成功建立小鼠下頜第一磨牙根尖周炎模型，并采用影像學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)的方法對根尖周炎模型進(jìn)行評價，實驗結(jié)果表明，與對照組相比，根尖周炎組根尖周病損形成，該模型的成功建立可便于進(jìn)一步研究根尖周炎炎癥發(fā)展機(jī)制。
　　2.本實驗成功建立并評價小鼠下頜第一磨牙去髓后血運(yùn)重建模型，且認(rèn)為玻璃離