ARHI基因?qū)侨饬黾?xì)胞生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、骨肉瘤(Oseteosarcoma)亦稱為成骨肉瘤，是一種常見于兒童和青少年時(shí)期的惡性原發(fā)性骨腫瘤。早期即可發(fā)生廣泛的肺轉(zhuǎn)移，死亡率高，是導(dǎo)致兒童和青少年死亡的最常見的疾病之一。其總體發(fā)病率各國(guó)統(tǒng)計(jì)數(shù)字差異較大，約1/10萬(wàn)~0.1/10萬(wàn)。盡管當(dāng)前新的輔助化療及手術(shù)技術(shù)有了進(jìn)一步的發(fā)展和提高，骨肉瘤患者的生存率也因此顯著提高了，但仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)化療效果差，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的情況。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)研究和技術(shù)的不斷發(fā)展，骨肉瘤的最

2、新研究已進(jìn)入基因治療、靶向治療階段，從分子水平研究腫瘤中相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)腫瘤的發(fā)生、演變、轉(zhuǎn)歸及治療具有重要意義。目前在腫瘤生物基因靶向治療及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制的研究方面出現(xiàn)了許多新的進(jìn)展，這為我們對(duì)骨肉瘤的預(yù)防和治療提供了新的方法和途徑。ARHI(aplasia ras homologue member I)，是一個(gè)母源性印記基因。它又被稱為DiRas3或NOEY2，于1999年被首次發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)研究表明，其編碼蛋白在人類的胰腺、乳

3、腺、卵巢等多個(gè)組織中存在著不同的表達(dá)。但是，它在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌等多種腫瘤中則表現(xiàn)為表達(dá)缺失或下調(diào)，提示ARHI基因與上述腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。ARHI基因作為一個(gè)抑癌基因，其在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、侵襲遷移以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干預(yù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面扮演著重要角色。ARHI作為一種新的研究目的基因，為腫瘤的分子水平基因治療探索提供了新的思路。ARHI基因在腫瘤中的應(yīng)用研究尚處于初始階段，迄今在國(guó)內(nèi)外的研究領(lǐng)

4、域尚無(wú)關(guān)于骨肉瘤中ARHI基因的表達(dá)和ARHI基因?qū)侨饬錾飳W(xué)特性影響及相關(guān)機(jī)制研究的文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于上述原因，本實(shí)驗(yàn)將通過構(gòu)建目的基因ARHI穩(wěn)定表達(dá)的骨肉瘤MG-63、U2OS和SAOS-2細(xì)胞系，對(duì)ARHI基因在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況作以研究，并以此為依據(jù)，深入探討ARHI基因?qū)侨饬錾飳W(xué)特性的影響及其作用機(jī)制，以期為骨肉瘤的基因診斷及治療提供更多理論支撐和依據(jù)。本研究分為四個(gè)部分：
　　第一部分：ARHI基因在人骨肉瘤細(xì)

5、胞及正常成骨細(xì)胞中的表達(dá)及意義。
　　目的：研究ARHI基因在人骨肉瘤細(xì)胞及正常成骨細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討ARHI基因在人骨肉瘤中表達(dá)的生物學(xué)意義。
　　方法：分為3種人骨肉瘤細(xì)胞系(MG-63、U2OS、SAOS-2)和人正常成骨細(xì)胞hFOB1.19，采用RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)ARHI基因mRNA和蛋白的表達(dá)情況，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，揭示在正常的成骨細(xì)胞中是否存在ARHI基因的表達(dá)以及其在人骨肉瘤

6、細(xì)胞中表達(dá)的變化情況。
　　結(jié)果：⑴應(yīng)用RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)了骨肉瘤細(xì)胞系中ARHI基因mRNA及蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示其內(nèi)均存有不同程度ARHI基因表達(dá)。⑵RT-PCR顯示骨肉瘤細(xì)胞系中ARHI mRNA表達(dá)水平低于正常成骨細(xì)胞，以MG-63細(xì)胞下降最為顯著，表達(dá)水平有顯著性差異（P<0.05）。⑶Western blot法檢測(cè)結(jié)果：骨肉瘤細(xì)胞系中ARHI蛋白表達(dá)水平低于正常成骨細(xì)胞，以MG-63細(xì)胞

7、下降最為顯著，表達(dá)水平有顯著性差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：ARHI基因在骨肉瘤細(xì)胞系中普遍低表達(dá)，提示其表達(dá)可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，影響骨肉瘤的生物學(xué)行為。
　　第二部分：ARHI基因轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞陽(yáng)性克隆穩(wěn)定株的構(gòu)建及鑒定。
　　目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的基因ARHI的骨肉瘤細(xì)胞系模型并進(jìn)行鑒定，為研究ARHI基因?qū)侨饬黾?xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定基礎(chǔ)。
　　方法：應(yīng)用基因克隆技術(shù)，構(gòu)建真核表達(dá)載體pc

8、DNA3.1-ARHI（攜帶目的基因ARHI基因編碼序列），將ARHI基因重組質(zhì)粒pcDNA3.l-ARHI和空載體質(zhì)粒pcDNA-3.1分別經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒提取擴(kuò)增和純化鑒定后，采用脂質(zhì)體法分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、U2OS、SAOS-2，通過G418篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ARHI基因的骨肉瘤細(xì)胞系模型。擴(kuò)增培養(yǎng)后應(yīng)用RT-PCR及Western blot法分別檢測(cè)骨肉瘤MG-63、U2OS、SAOS-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后目的基因

9、ARHI在 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：⑴真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.l-ARHI轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系和空載體pcDNA3.l轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系均獲得新霉素抗性，通過G418篩選，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ARHI基因的骨肉瘤細(xì)胞系。⑵通過RT-PCR、Western blot法檢測(cè)顯示重組質(zhì)粒pcDNA3.l-ARHI轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系后，目的基因ARHI在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)均較空載體組和未轉(zhuǎn)染組有顯著增高（P<0.05），而

10、空載體組和未轉(zhuǎn)染組的ARHI表達(dá)則沒有明顯不同（P>0.05）。
　　結(jié)論：應(yīng)用基因克隆技術(shù)在體外成功構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)目的基因ARHI的骨肉瘤細(xì)胞系。
　　第三部分：ARHI基因調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移的體外研究。
　　目的：研究目的基因ARHI對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲遷移的影響，證實(shí)其在骨肉瘤中的生物學(xué)作用。
　　方法：以成功構(gòu)建的分別能穩(wěn)定表達(dá)外源 pcDNA3.1-ARHI、空載體pcDNA3

11、.1的骨肉瘤細(xì)胞系和未轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象。通過生長(zhǎng)曲線和MTT法分析ARHI基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)ARHI基因?qū)侨饬黾?xì)胞凋亡的影響；通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)研究ARHI基因?qū)侨饬黾?xì)胞侵襲遷移的影響。
　　結(jié)果：⑴從骨肉瘤MG-63、U2OS、SAOS-2細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線數(shù)據(jù)分析。ARHI組細(xì)胞生長(zhǎng)速度要比空載體組明顯

12、減慢，ARHI基因抑制了骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，尤其在72~96h，與空載體組比較，具有明顯的差異性（P<0.05）。⑵應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，可見ARHI組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢，對(duì)MG-63、U2OS和SAOS-2細(xì)胞均有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，ARHI組與空載體組比較，具有明顯的差異性（P<0.05）。⑶Annexin V-FITC/PI雙染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞凋亡情況，定量分析骨肉瘤MG-63細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARHI組MG-6

13、3凋亡細(xì)胞的百分率為29.7％，空載體組為4.31%。與空載體組比較，ARHI基因明顯增加了細(xì)胞凋亡百分率（P>0.05）。⑷通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)可以觀察到MG-63細(xì)胞在ARHI組較空載體組細(xì)胞侵襲能力明顯下降（P<0.05）；通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)可以觀察到MG-63細(xì)胞在ARHI組較空載體組細(xì)胞遷移能力明顯下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：①ARHI基因抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖；②ARHI基因誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生

14、凋亡；③ARHI基因抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移；④ARHI基因在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中是一個(gè)抑癌基因。
　　第四部分：小干擾RNA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞ARHI基因、蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及ARHI基因?qū)I3K/Akt信號(hào)通路的影響。
　　目的：研究小干擾RNA對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞ARHI基因的表達(dá)水平及細(xì)胞增殖、凋亡的影響；研究ARHI基因?qū)I3K/Akt信號(hào)通路和Caspase凋亡信號(hào)通路的影響。
　　方法：使

15、用化學(xué)合成法構(gòu)建針對(duì)ARHI的小干擾RNA，通過使用dharmafect4轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染入ARHI高表達(dá)的骨肉瘤MG-63細(xì)胞。通過RT-PCR、Western blot方法、MTT增殖實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)其對(duì)ARHI基因、蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞增殖、凋亡的影響；通過Western blot方法檢測(cè)ARHI基因?qū)I3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p-Akt和Akt蛋白表達(dá)的作用；通過Caspase-G

16、lo?3/7試驗(yàn)檢測(cè)ARHI基因?qū)aspase-3活性的影響。
　　結(jié)果：⑴成功構(gòu)建了針對(duì)ARHI基因的小干擾RNA；⑵通過RT-PCR檢測(cè)顯示，ARHI siRNA轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞48h后，與control siRNA轉(zhuǎn)染組比較。ARHI siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中ARHI mRNA的表達(dá)水平下降約92%，具有明顯差異性（P<0.05）；⑶通過Western blot方法檢測(cè)顯示，與control siRNA轉(zhuǎn)染組比較，ARHI

17、 siRNA轉(zhuǎn)染組MG-63細(xì)胞中ARHI蛋白表達(dá)水平下調(diào)，具有明顯差異性（P<0.05）；⑷應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)顯示，ARHI siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖較control siRNA轉(zhuǎn)染組有所增加，具有明顯差異性（P<0.05）；⑸流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，ARHI siRNA轉(zhuǎn)染48h后MG-63細(xì)胞的凋亡率4.8%，明顯低于control siRNA轉(zhuǎn)染組31.1%，具有顯著差異性（P<0.05）；⑹在ARHI基因轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞72h

18、后，觀察p-Akt蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染ARHI基因后，與空載體比較，發(fā)現(xiàn)磷酸化的p-Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而通過RNAi技術(shù)使ARHI基因沉默則顯著上調(diào)了p-Akt蛋白表達(dá)，然而control siRNA轉(zhuǎn)染組p-Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變；⑺Caspase-Glo?3/7試驗(yàn)檢測(cè)ARHI基因轉(zhuǎn)染組與ARHI基因沉默組細(xì)胞中Caspase-3活性均較對(duì)照組無(wú)顯著改變（P>0.05）。
　　結(jié)論：①成功地合成了ARHI