骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肺泡上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的體外分離擴(kuò)增及鑒定 目的：探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）體外進(jìn)行分離、純化及鑒定的方法。 方法：采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁細(xì)胞分離法培養(yǎng)小鼠MSCs，觀察不同代細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠MSCs表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106等的表達(dá)情況，并對(duì)小鼠MSCs進(jìn)行純度測(cè)定。 結(jié)果：小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）原代培養(yǎng)接種24小時(shí)后可見

2、圓形細(xì)胞貼壁，72小時(shí)后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，此時(shí)貼壁的細(xì)胞形態(tài)比較均一，為長(zhǎng)梭形。在細(xì)胞培養(yǎng)的2～5天細(xì)胞增殖較慢，6～10天細(xì)胞快速增殖，呈“旋渦樣”排列。培養(yǎng)至11～13天，細(xì)胞接近80～90%融合，細(xì)胞形態(tài)均一。傳代后的小鼠MSCs呈梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞不再以集落方式生長(zhǎng)，而呈均勻性分布生長(zhǎng)。分離純化后所得細(xì)胞活力為93.2±1.8%。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示第2代小鼠MSCs細(xì)胞均一性較好，在95%以上；CD34

3、、CD45表達(dá)陰性，CD105、CD106表達(dá)陽(yáng)性。 結(jié)論：采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁細(xì)胞分離法體外分離和擴(kuò)增小鼠MSCs，所得小鼠MSCs活力及純度均較高，可以作為小鼠MSCs的原代培養(yǎng)的常規(guī)方法；流式細(xì)胞技術(shù)可以鑒定體外分離培養(yǎng)的小鼠MSCs。 第二章、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的非接觸共培養(yǎng)模型 目的：建立體外非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠MSCs向肺泡上皮細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?方法：采用密度梯度離心法結(jié)合

4、貼壁細(xì)胞分離法，體外分離培養(yǎng)小鼠MSCs，選取第3代小鼠MSCs。無菌條件下制備肺組織單細(xì)胞懸液。將小鼠肺細(xì)胞懸液接種于0.4um孔徑（Millpore）大小的膜上（懸掛式體外共培養(yǎng)小室），并放入24孔板中，在24孔板的底部接種小鼠MSCs。共設(shè)計(jì)三組：對(duì)照組：小鼠MSCs單獨(dú)靜置培養(yǎng)組；實(shí)驗(yàn)組A：正常肺組織單細(xì)胞懸液+MSCs：實(shí)驗(yàn)組B：損傷組肺組織單細(xì)胞懸液+MSCs。共同培養(yǎng)8天，每日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，透射電

5、鏡觀察MSCs的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，激光共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡觀察共培養(yǎng)體系下室MSCs、SP-C和AQP5免疫熒光表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)共培養(yǎng)體系下室中SP-C和AQP5 mRNA表達(dá)情況。 結(jié)果：小鼠MSCs的細(xì)胞生長(zhǎng)情況：對(duì)照組：細(xì)胞增殖良好，形態(tài)不變，為長(zhǎng)梭形，見個(gè)別寬大、扁平的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組A：共同培養(yǎng)的前4天，細(xì)胞形態(tài)基本為長(zhǎng)梭形，第5天開始見少量細(xì)胞變?yōu)榱⒎叫危⑦M(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?，共同培養(yǎng)8天，可見約30～40%的細(xì)胞轉(zhuǎn)

6、變?yōu)槎嘟切渭?xì)胞。實(shí)驗(yàn)組B：第2天開始，即可見部分細(xì)胞由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)榱⒎叫?，并進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切危w積增大，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種多角形細(xì)胞逐漸增多。培養(yǎng)8天時(shí)，大約60～70%的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切渭?xì)胞。不同處理組小鼠MSCs的增值情況比較顯示：實(shí)驗(yàn)組B與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A比較，共培養(yǎng)體系的下室中的細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P<0.05）；但實(shí)驗(yàn)組A與對(duì)照組比較，各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相均無明顯差異（P>0.05）。不同處理組小鼠MSCs細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：對(duì)照組

7、和實(shí)驗(yàn)組A均未見到肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物板層小體；實(shí)驗(yàn)組B，可見較多細(xì)胞胞漿內(nèi)有板層小體。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)室成功建立體外非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠MSCs分化為肺泡上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并證實(shí)損傷的肺組織可以促進(jìn)小鼠MSCs誘導(dǎo)分化為肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（AECⅡ）。 第三章、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的影響 目的：觀察角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，KGF）對(duì)

8、體外小鼠MSCs向肺泡上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。 方法：同第二章。共設(shè)計(jì)三組：對(duì)照組：小鼠MSCs單獨(dú)靜置培養(yǎng)+KGF（10μl/ml）；實(shí)驗(yàn)組A：正常肺組織單細(xì)胞懸液+MSCs+KGF（10μl/ml）；實(shí)驗(yàn)組B：損傷肺組織單細(xì)胞懸液+MSCs+KGF（10μl/ml）。觀察指標(biāo)也同第二章。 結(jié)果：小鼠MSCs的細(xì)胞生長(zhǎng)情況：鏡下觀察共同培養(yǎng)8天細(xì)胞情況：對(duì)照組：細(xì)胞增殖良好，大多數(shù)為長(zhǎng)梭形細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組A：可見約40～5

9、0%的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切渭?xì)胞；實(shí)驗(yàn)組B，大約70～80%的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切渭?xì)胞，細(xì)胞呈多層重疊生長(zhǎng)，細(xì)胞之間界限模糊。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示實(shí)驗(yàn)組B各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，比實(shí)驗(yàn)組A和對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P<0.05）；但實(shí)驗(yàn)組A與對(duì)照組相比較無明顯差異（P>0.05）。不同處理組小鼠MSCs細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：透射電鏡觀察，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A的共培養(yǎng)下室中均未見到肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物板層小體；而實(shí)驗(yàn)組B細(xì)胞胞漿內(nèi)見有較多板層小體。于共培養(yǎng)第8天觀察各

10、處理組小鼠MSCs、SP-C和AQP5的免疫熒光表達(dá)：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A都只檢測(cè)到hoechst33342標(biāo)記的MSCs的藍(lán)色熒光，AQP5的紅色熒光，而未見到綠色的SP-C的熒光；但在實(shí)驗(yàn)組B，則可同時(shí)檢測(cè)到hoechst33342標(biāo)記的MSCs的藍(lán)色熒光，AQP5的紅色熒光，以及綠色的SP-C的熒光。RT-PCR檢測(cè)MSCs中SP-C和AQP5 mRNA表達(dá)情況：于1、5、8天檢測(cè)各處理組的AQP5和SP-CmRNA的表達(dá)情況，對(duì)照組

11、在共培養(yǎng)開始第1天，可檢測(cè)到AQP5的mRNA表達(dá)，但AQP5的表達(dá)比較弱，不同時(shí)間段差異不明顯，而在不同時(shí)間段SP-C都沒有表達(dá)。 結(jié)論：在與損傷肺組織共同培養(yǎng)體系中，角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）可以促進(jìn)小鼠MSCs向肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（AECⅡ）誘導(dǎo)分化。 第四章、地塞米松對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的影響 目的：觀察地塞米松（Dexamethasone）對(duì)體外小鼠MSCs向肺泡上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。

12、 方法：實(shí)驗(yàn)方法同第二章，觀察指標(biāo)也同第二章。實(shí)驗(yàn)分組：共分6組，每組6孔。于下列共培養(yǎng)體系中，細(xì)胞培養(yǎng)液所加入的Dex的濃度為10-8mol/L，KGF濃度為10ul/ml。對(duì)照組A：MSCs+Dex，實(shí)驗(yàn)組A：正常肺組織單細(xì)胞懸液+MSCs+Dex，實(shí)驗(yàn)組B：損傷肺組織單細(xì)胞懸液+MSCs+Dex，對(duì)照組B：MSCs+Dex+KGF，實(shí)驗(yàn)組C：正常肺組織單細(xì)胞懸液+MSCs+Dex+KGF，實(shí)驗(yàn)組D：損傷肺組織單細(xì)胞懸液+MSCs+

13、Dex+KGF。 結(jié)果：小鼠MSCs的細(xì)胞生長(zhǎng)情況：小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）培養(yǎng)系統(tǒng)中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中同時(shí)加Dex和KGF，培養(yǎng)8天，比單獨(dú)加入Dex細(xì)胞增值情況好，多角形細(xì)胞比較多（P<0.05）。而損傷的肺組織單細(xì)胞懸液共培養(yǎng)系統(tǒng)比其它處理組細(xì)胞增值更加良好，有更多的多角形細(xì)胞（P<0.05）。不同處理組小鼠MSCs細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：小鼠MSCs+Dex培養(yǎng)系統(tǒng)，加入正常肺組織，以及小鼠MSCs+KGF+Dex培養(yǎng)系統(tǒng)，

14、加入正常肺組織，均未見到有肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞板層小體表達(dá)。但在這兩個(gè)共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入損傷肺組織懸液時(shí)，小鼠MSCs+Dex培養(yǎng)系統(tǒng)的共培養(yǎng)下室可見少部分細(xì)胞胞漿內(nèi)見到板層小體。而小鼠MSCs+KGF+Dex培養(yǎng)系統(tǒng)下室中，則見到較多的細(xì)胞胞漿中有肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞板層小體。于共培養(yǎng)第8天，觀察不同處理組小鼠MSCs中的SP-C、AQP5的免疫熒光表達(dá)：對(duì)照組A和實(shí)驗(yàn)組A都只檢測(cè)到hoechst33342標(biāo)記的MSCs的藍(lán)色熒光，AQP5的紅

15、色熒光，而未見到綠色的SP-C的熒光；而在實(shí)驗(yàn)組B，則可同時(shí)檢測(cè)到hoechst33342標(biāo)記的MSCs的藍(lán)色熒光，AQP5的紅色熒光，以及綠色的SP-C的熒光。比細(xì)胞培養(yǎng)液中未加入Dex，表達(dá)熒光的細(xì)胞稍減少。在培養(yǎng)液中同時(shí)加入Dex和KGF，對(duì)照組B和實(shí)驗(yàn)組C都只檢測(cè)到hoechst33342標(biāo)記的MSCs的藍(lán)色熒光，AQP5的紅色熒光，而未見到綠色的SP-C的熒光；培養(yǎng)體系中表達(dá)熒光的細(xì)胞相應(yīng)比單獨(dú)加Dex增多。實(shí)驗(yàn)組D，則可同時(shí)

16、檢測(cè)到hoechst33342標(biāo)記的MSCs的藍(lán)色熒光，AQP5的紅色熒光，以及綠色的SP-C的熒光。培養(yǎng)體系中表達(dá)熒光的細(xì)胞相應(yīng)比單獨(dú)加Dex明顯增多。RT-PCR檢測(cè)MSCs中SP-C和AQP5 mRNA表達(dá)情況：在細(xì)胞培養(yǎng)液中未加入Dex，于培養(yǎng)1、5、8天檢測(cè)各處理組的AQP5和SP-C mRNA的表達(dá)情況，對(duì)照組A和實(shí)驗(yàn)組A可檢測(cè)到AQP5的mRNA表達(dá)，而在不同時(shí)間段SP-C都沒有表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組B在共培養(yǎng)的各時(shí)間段可同時(shí)檢測(cè)到

17、AQP5和SP-C mRNA的表達(dá)。在培養(yǎng)液中同時(shí)加入Dex和KGF，于培養(yǎng)1、5、8天檢測(cè)各處理組的AQP5和SP-C mRNA的表達(dá)情況，對(duì)照組B和實(shí)驗(yàn)組C可檢測(cè)到AQP5的mRNA表達(dá)，沒有SP-C mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組D在共培養(yǎng)的各時(shí)間段可同時(shí)檢測(cè)到AQP5和SP-C mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)的研究表明：在損傷的肺組織微環(huán)境中，地塞米松（Dex）單獨(dú)或與角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）共同作用時(shí)，都可以促使共培養(yǎng)體系中