酵母轉醛醇酶2晶體結構與功能研究及鉤端螺旋體DDG醛縮酶初步晶體學研究.pdf

1、醛縮酶是一類裂解酶，狹義的醛縮酶指的是1，6-二磷酸-D-果糖醛縮酶(EC4.1.2.13)，它可以催化裂解1，6-二磷酸-D-果糖，生成3-磷酸-D-甘油醛和α-二羥丙酮磷酸這樣一個可逆的醛醇縮合裂解反應。而廣義的醛縮酶包括很多催化同類型反應的酶，本論文中研究的轉醛醇酶(轉二羥丙酮基酶)(EC2.2.1.2)和2-脫氫-3-脫氧葡糖二酸醛縮酶(EC4.1.2.20)都屬于醛縮酶家族。醛縮酶參與糖酵解過程，可以高效地催化酮對受體醛的立體

2、選擇性加成，即催化代謝物質C-C鍵的形成與斷裂，而C-C鍵的立體選擇性形成是有機合成化學領域的一個重要反應。所以，醛縮酶作為一種很有前景的生物合成劑被廣為研究和應用。 根據(jù)催化性質的差異，可以把醛縮酶分為兩個類型：Ⅰ型醛縮酶和Ⅱ型醛縮酶。前者主要存在于高等植物以及動物中，該型醛縮酶酶活能力的發(fā)揮需要在酶的核心結構的一個賴氨酸(Lysine)殘基形成Schiff堿中間體；后者主要存在于細菌和真菌中，在其催化過程中，需要二價金屬陽離

3、子在其活性部位作為輔因子發(fā)揮作用。 轉醛醇酶屬于Ⅰ型醛縮酶，在糖代謝戊糖磷酸途徑的非氧化階段能夠可逆的催化景天庚酮糖-7-磷酸的二羥丙酮部分轉移給甘油醛-3-磷酸，生成果糖-6-磷酸和赤蘚糖-4-磷酸。酵母基因組的一個開放閱讀框NQM1/YGR043C編碼的一段氨基酸序列運用COG數(shù)據(jù)庫分析認為是一個轉醛醇酶，但是關于這個基因目前為止還沒有任何直接的實驗證據(jù)。本課題的目的就是希望了解它并證明它是否是一個轉醛醇酶。 2-脫

4、氫-3-脫氧葡糖二酸醛縮酶屬于Ⅱ型醛縮酶，能夠可逆的催化2-脫氫-3-脫氧葡糖二酸分裂成丙醇二酸半醛和丙酮酸。作為丙酮酸代謝途徑中非常重要的酶，鉤端螺旋體2-脫氫-3-脫氧葡糖二酸醛縮酶被當成抗鉤端螺旋體病的生物制劑的一種靶蛋白而備受重視。 (一)關于NQM1/YGR043C的課題，我們從酵母基因組中克隆出了該基因，并成功構建其pET22b(+)和pET28a載體的表達質粒；表達并純化了此重組蛋白；利用轉醛醇酶酶活實驗證實了其確

5、實存在轉醛醇酶活性；利用懸滴氣相擴散法篩選出了NQM1/YGR043C晶體的初步生長條件，通過優(yōu)化最終獲得了適于X-ray衍射的晶體；在北京同步輻射收集了一套1.9A的常規(guī)數(shù)據(jù)，空間群為I212121，晶胞參數(shù)為a=85.03A，b=113.46A，c=158.92A，α=β=γ=90°；利用分子置換方法解析出了NQM1/YGR043C晶體的衍射相位，并通過模型構建和精修獲得了1.9A分辨率的最終結構模型。 NQM1/YGR04

6、3C核心結構是一個非常保守的(α/β)8桶，8個扭曲的平行的βstrand(β1-8strand)排列在一起組成一個很像啤酒桶的結構內核，連接這些彼此平行的βstrand的7個α螺旋(α2-8螺旋，缺失α1螺旋)纏繞在桶的外沿，另外，在核心的(α/β)8桶外周還圍繞著7個α螺旋(αA-G螺旋)。 分析NQM1/YGR043C與同源轉醛醇酶的氨基酸序列和二級結構分布，所有轉醛醇酶亞家族的特征性高度保守的殘基都能在NQM1/YGR0

7、43C中發(fā)現(xiàn)。比較NQM1/YGR043C與同源轉醛醇酶(人源轉醛醇酶和大腸桿菌轉醛醇酶B)的三維結構，證實其和同源物之間不僅具有非常相似的整體結構和核心的(α/β)8桶結構。而且所有關鍵的活性相關的氨基酸殘基，位置和構象都保持了高度的一致。另外在TAL2_YEAST(NQM1/YGR043C)晶體結構的表面發(fā)現(xiàn)了文獻報道中提到的轉醛醇酶的可能的底物傳遞通道，這一通道從Ser173殘基直至Lvs144殘基，主要由β4、β5strand及

8、緊隨β5strand的一段loop上的若干氨基酸殘基組成。 綜上實驗發(fā)現(xiàn)和證據(jù)，證實NQM1/YGR043C編碼的確實是一個轉醛醇酶，TAL2_YEAST，另外還推斷了TAL2_YEAST與其同源酶相似的催化過程。 (二)關于鉤端螺旋體2-脫氫-3-脫氧葡糖二酸醛縮酶，我們從含有目的基因的質粒中克隆出了編碼鉤端螺旋體DDG醛縮酶的基因，并成功構建其pET22b(+)載體的表達質粒；表達并純化了鉤端螺旋體DDG醛縮酶蛋白；

9、利用懸滴氣相擴散法篩選出了鉤端螺旋體DDG醛縮酶晶體的初步生長條件，并通過優(yōu)化獲得了分辨率高于3A的晶體；利用金屬離子和甘油濃度梯度篩選出合適的冷凍保護策略，提高了鉤端螺旋體DDG醛縮酶晶體耐受X-Ray的能力，足以收取完整的數(shù)據(jù)；在實驗室常規(guī)光源收集了一套2.2A的常規(guī)數(shù)據(jù)，晶體空間群類型屬于C2,晶胞參數(shù)為a=293.5A，b=125.6A，c=87.6A，α=γ=90°，β=100.9°，并利用分子置換方法得到了一個初步的相位。