STING蛋白的初步晶體學研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、STING蛋白是天然免疫一型干擾素生成通路中的一個銜接調(diào)控蛋白,在細菌、病毒和真核病原菌的所引起的天然免疫反應中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。近來研究發(fā)現(xiàn),STING可以作為免疫感受器識別結合來自病原菌中的第二信使分子c-di-GMP而激活下游通路。之前的研究預測STING蛋白主要包含一個預測的N端五次跨膜部分(1-173aa)和C端胞內(nèi)可溶性的胞質(zhì)結構域(174-379aa)。有關N端的功能目前仍不清楚,可能與其在細胞內(nèi)的定位有關,如

2、之前的研究中發(fā)現(xiàn)其可能定位于線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。C端胞質(zhì)結構域(C-terminal domain,CTD)可通過募集相互作用分子而發(fā)揮重要的信號調(diào)控作用。STING蛋白的氨基酸序列與PDB中任何已知結構的蛋白質(zhì)都沒有同源性,預示它可能擁有獨特的三維結構。為闡述STING接受c-di-GMP信號而發(fā)揮功能的分子機制,我們利用x-射線晶體學方法對其進行了結構生物學的研究。
   首先,通過對不同STING蛋白的片段在大腸桿菌內(nèi)的表

3、達分析,我們得到了其可溶性的C端胞質(zhì)結構域片段(149位氨基酸到379位氨基酸),命名為STINGCTD。然后利用座滴法進行晶體普篩工作,最后在14.4%PEG3350,0.08M二甲砷酸鈉(PH=6.5)和0.16M氯化鈣和20%(v/v)甘油條件下長出了晶體。由于坐滴法普篩中得到的晶體難以達到X-射線衍射及結構解析的要求,因此我們用懸滴法對STINGCTD蛋白進行了晶體的優(yōu)化工作。主要通過以下幾個方面:一是將晶體生長條件中的緩沖液P

4、H和沉淀劑濃度在上述條件附近進行拉梯度;二是在晶體生長緩沖液中加入不同種類的additive和detergent;三是降低晶體生長的溫度,在4度下進行晶體的優(yōu)化培養(yǎng);四是將晶體進行乙酸鋰脫水處理。最終我們獲得了適合x-射線晶體衍射并具有較高衍射分辨率的單晶,并在上海同步輻射中心收到了一套2.2(A)的衍射數(shù)據(jù)。初步處理結果表明STINGCTD的晶體屬C2221空間群,每個非對稱單位中含有一個STINGCTD蛋白分子,該分子與另一對稱相關

5、的分子形成一同源二聚體。由于STING蛋白在PDB數(shù)據(jù)庫中沒有具有較高同源性的蛋白質(zhì)結構(大于30%),因此我們考慮用STING蛋白的硒代衍生物來解決晶體結構解析中的相位求解問題。我們在native蛋白普篩長出晶體的條件中直接進行硒代衍生物晶體的優(yōu)化培養(yǎng),最終通過利用native蛋白的晶體進行種晶(seeding)的方法獲得STINGCTD硒代衍生物的單晶,并在上海同步輻射中心收到了一套2.70(A)的數(shù)據(jù)。SeMet-STINGCTD

6、的晶體屬P21空間群,每個非對稱單位也僅含有一個SeMet-STINGCTD蛋白分子,該分子與另一對稱相關的分子形成同源二聚體。
   利用單波長反常散射發(fā)(SAD)法解析的apo-STINGCTD結構中,STINGCTD以對稱二體的形式存在,以(Ⅴ)型結構存在,文獻中預測的第五段長α螺旋其實并不是跨膜序列,而是作為STING胞質(zhì)結構域的組成部分參與二聚體相互作用界面的形成,并在二聚體內(nèi)部參與形成疏水核心,該結構是一種全新的折疊

7、形式。
   由于解析的apo-STINGCTD結構中,STINGCTD以同源二聚體(dimer)的形式存在。為了驗證STINGCTD二聚體的形成并不是晶體堆積所造成的一種人為結果,因此我們利用凝膠過濾層析法對STINGCTD蛋白在沒有和加入c-di-GMP的情況下的分子大小。結果表明,STING蛋白在溶液中是以同源二聚體的形式存在,并且不受c-di-GMP的調(diào)控。另外,我們利用等溫滴定量熱法檢測了STINGCTD與c-di-G

8、MP的親和力,其解離常數(shù)Kd值為3.70uM,復合物中STINGCTD與c-di-GMP的化學計量數(shù)之比為2∶1,即一分子的c-di-GMP結合兩分子的STINGCTD,這與之前的研究結果相一致。
   為了闡述STINGCTD識別c-di-GMP的分子機制,我們對STINGCTD與c-di-GMP的復合物進行了晶體的優(yōu)化培養(yǎng),并最終收到了一套2.40(A)的數(shù)據(jù),通過對衍射數(shù)據(jù)的初步分析,我們發(fā)現(xiàn),c-di-GMP結合的STI

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