豆薯種子蛋白Spe31的分離純化、性質(zhì)研究和初步晶體學分析.pdf

1、豆薯(Pachyrrhizus erosus)種子經(jīng)磷酸鹽緩沖液抽提,硫酸銨飽和沉淀,DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析和Superdex 75 HR 10/30柱層析,提取出兩種含量較豐富的蛋白成分,根據(jù)它們在SDS-PAGE中的表觀分子量為31 kDa和32 kDa而將二者分別命名為Spe31和Spe32.SDS-PAGE電泳還顯示Spe31的含量要比Spe32的含量少而且二者在聚丙烯酰胺凝膠中的位置極為接近.用

2、柱層析的方法將Spe31和Spe32分離開的嘗試是不成功的,Superdex 75 HR 10/30凝膠過濾層表明二者在溶液中均為單體.在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳中純化出的蛋白樣品仍然是兩條帶,說明Spe31和Spe32既沒有共價連接也沒有通過非共價作用形成聚集體.在還原性條件下Spe31和Spe32在SDS-PAGE凝膠中的遷移律均小于它們在非還原性條件下的遷移律,表明二者均含有鏈內(nèi)二硫鍵.用雙向電泳和IEF-PAGE測得Spe31

3、的等電點為4.0,Spe32的等電點為4.2.在用高碘酸和西佛氏試劑相結(jié)合的糖蛋白檢測方法(PAS方法)中Spe31和Spe32均呈現(xiàn)紫色條帶,這表明在二者的多肽鏈上均含有共價結(jié)合的雜糖鏈.Spe31的N端20個氨基酸殘基的序列為DAPESWDWSKKGVITEVKFQ,Spe32的N端17個氨基酸殘基的序列為EKKK(C/K)EQPSSDDAPESW(其中第五位的氨基酸殘基無法確定是半胱氨酸還是賴氨酸),二者之間6個氨基酸殘基的重疊D

4、APESW.對蛋白序列數(shù)據(jù)庫的同源性搜索結(jié)果顯示Spe31和Spe32應屬于木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶.在凝膠中的蛋白酶活性檢測顯示Spe31具有明顯的降解明膠蛋白的活性,而Spe32只顯示出極微弱的蛋白酶活性.用懸滴氣象擴散法獲得了此豆薯種子蛋白樣品的質(zhì)量較好的晶體,非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示發(fā)生結(jié)晶的是Spe31而不是Spe32.在室內(nèi)的X光源上進行了Spe31晶體2.61 A衍射數(shù)據(jù)的收集,數(shù)據(jù)處理結(jié)果顯示晶體所屬的空間群為