SET-TAF-Iβ和CHMP6的克隆、表達(dá)、純化以及初步晶體學(xué)分析.pdf

1、在真核細(xì)胞中，所有的基因組DNA與高度進(jìn)化保守的堿性蛋白一組蛋白以及多種組蛋白相關(guān)染色質(zhì)因子組裝構(gòu)成核小體結(jié)構(gòu)，重復(fù)的核小體結(jié)構(gòu)組成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)影響到多種參與基因調(diào)控的酶以及因子與DNA的相互作用。因此染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的維持與調(diào)節(jié)對于真核細(xì)胞基因調(diào)控是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變主要依賴于組蛋白的修飾以及構(gòu)象改變，所以組蛋白分子伴侶是參與組蛋白修飾調(diào)控重要的因子之一。
　　 組蛋白分子伴侶SET也被稱為模板活化因子te

2、mplate activating factorⅠβ(TAF-Ⅰβ)，由set基因所編碼。該基因最初是在急性非分化白血病(AUL)中被鑒定，因?yàn)榘l(fā)生基因易位而與can基因形成融合基因。SET/TAF-Ⅰβ屬于核小體組裝蛋白(NAP)家族。隨后的一系列功能試驗(yàn)結(jié)果顯示，SET/TAF-Ⅰβ是一個(gè)具有多種功能的蛋白質(zhì)，它可以參與到眾多的生理途徑：包括組蛋白結(jié)合，核小體組裝，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄激活以及凋亡等等。生化試驗(yàn)結(jié)果表明，SET/TAF-

3、Ⅰβ含有一個(gè)位于羧基末端的酸性結(jié)構(gòu)域(acidic domain)。只有在含有酸性結(jié)構(gòu)域的情況下，SET/TAF-Ⅰβ才具有結(jié)合H2A-H2B組蛋白以及抑制組蛋白乙酰化的活性。
　　 已經(jīng)被分離的十類組蛋白分子伴侶的一級結(jié)構(gòu)具有高度的多樣性。由于對它們的四級結(jié)構(gòu)的了解甚少，故而對結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究還未統(tǒng)一。最近基于結(jié)構(gòu)與功能的研究顯示組蛋白分子伴侶之間的相似性與差異性，為深入了解組蛋白組裝與分解的機(jī)理提供了基礎(chǔ)。目前人源的SE

4、T/TAF-Ⅰβ的完整結(jié)構(gòu)還一直未被解析，為了詳細(xì)了解SET/TAF-Ⅰβ的結(jié)構(gòu)以及作用機(jī)理，我們克隆，表達(dá)以及純化了截去氨基末端的22個(gè)氨基酸殘基并具有羧基末端的酸性結(jié)構(gòu)域的人源SET/TAF-Ⅰβ蛋白，采用懸滴氣相擴(kuò)散法，獲得了具有良好X射線衍射能力的人源SET/TAF-Ⅰβ蛋白晶體，并成功收集一套衍射分辨率為2.7A的晶體衍射數(shù)據(jù)，初步晶體學(xué)分析顯示SET/TAF-Ⅰβ晶體屬于P43212空間群。
　　 囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)分類內(nèi)涵體

5、(ESCRT)是參與調(diào)控跨膜蛋白質(zhì)下調(diào)以及降解過程的一類重要復(fù)合物。其生物學(xué)功能的發(fā)揮，依賴于胞內(nèi)相應(yīng)的各個(gè)亞基間的相互協(xié)調(diào)而構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜而精確的調(diào)控體系。生化實(shí)驗(yàn)研究表明ESCRT復(fù)合體由三個(gè)亞復(fù)合體組成，分別命名為ESCRT-Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。已有許多學(xué)者對ESCRT復(fù)合體及其相關(guān)蛋白質(zhì)做了深入的研究工作并做出相關(guān)報(bào)道，但是具體的作用機(jī)制目前仍不甚清楚。對其結(jié)構(gòu)的研究將為人們探索跨膜蛋白的降解機(jī)制提供重要基礎(chǔ)。我們的工作主要集中于ESC

6、RT-Ⅲ中CHMP6亞基各個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。本論文研究計(jì)劃中，已經(jīng)順利完成了整個(gè)課題的前期工作，包括CHMP6人工嵌合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)、純化、晶體生長條件的篩選。
　　 本文簡要介紹了CHMP6蛋白作為囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)分類復(fù)合體亞單位的生物學(xué)功能，并對它與相關(guān)蛋白的同源性及保守性進(jìn)行了一些討論。文章中較為細(xì)致地討論了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，材料與方法，操作過程及其遇到的問題與相應(yīng)的解決方案，最后闡述了現(xiàn)階段已取得的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果做