不同濃度雌二醇對體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　本實驗通過觀察不同濃度17β-雌二醇對體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞（HumanPeriodontal ligament cells，HPDLCs）的增殖、堿性磷酸酶活性以及細(xì)胞周期的影響，探討17β-雌二醇影響人牙周膜細(xì)胞生物學(xué)特性的有效濃度，為將17β-雌二醇作為一種新型的誘導(dǎo)劑應(yīng)用于正畸治療提供生物學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　選取因正畸治療需要拔除的健康前磨牙，在無菌條件下刮取牙周膜組織，采用組織塊結(jié)合酶消化法進(jìn)

2、行原代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至鋪滿瓶底約1/2時進(jìn)行首次傳代，從而獲得大量可供實驗用的種子細(xì)胞。取第4代對數(shù)生長期人牙周膜細(xì)胞爬片，進(jìn)行波形絲蛋白(VIM)和角蛋白(CK)免疫組織化學(xué)染色鑒定細(xì)胞來源，倒置顯微鏡下觀察。將處于對數(shù)生長期的第4代人牙周膜細(xì)胞用于實驗，細(xì)胞隨機(jī)分為6組:5個實驗組和1個對照組。實驗組:在相應(yīng)的有細(xì)胞孔內(nèi)分別加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液配置的終末濃度分別為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9

3、mol/L的17β-雌二醇。對照組:在相應(yīng)的有細(xì)胞孔內(nèi)加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。每天換液以維持藥物濃度恒定。
　　1、MTS比色法檢測17β-雌二醇對人牙周膜細(xì)胞增殖的影響:實驗組和對照組PDLCs分別于培養(yǎng)24h、48h、72h和7d時隨機(jī)取出一個96孔培養(yǎng)板，向所測孔內(nèi)加入30μl MTS，在37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h，酶標(biāo)儀上測定490nm下各孔的吸光度值。
　　2、BCIP/NBT法

4、檢測17β-雌二醇對人牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響:實驗組和對照組PDLCs經(jīng)17β-雌二醇誘導(dǎo)7d后，吸棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌2-3遍，4％多聚甲醛固定1h，PBS洗滌2-3遍，每孔加入1ml BCIP/NBT工作液，室溫避光放置30 min，吸棄工作液，PBS洗滌2-3遍，自然光下拍照。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)檢測17β-雌二醇對人牙周膜細(xì)胞細(xì)胞周期的影響:實驗組和對照組PDLCs在培養(yǎng)96h后進(jìn)行細(xì)胞周期實驗，按照細(xì)胞周期試劑

5、盒說明書操作，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
　　結(jié)果：
　　1、體外分離培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞抗波形絲蛋白多克隆抗體(VIM)在細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，抗細(xì)胞角蛋白(CK)呈陰性表達(dá)，證實細(xì)胞的間葉源性，而非上皮源性，符合實驗要求。
　　2、與對照組相比，在一定濃度范圍內(nèi)17β-雌二醇能促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的增殖、提高堿性磷酸酶活性及推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，其中以濃度為10-8 mol/L的17β-雌二醇作用最為明顯。
　　結(jié)論：