賁門癌和食管BRAF基因突變及蛋白表達的分析.pdf

1、目的:賁門癌是我國特別是北方地區(qū)一種常見的消化道惡性腫瘤，國際衛(wèi)生組織(World Health Organization，簡稱WHO)將騎跨于食管和胃交界處的腺癌性病變定義為賁門癌，其具有特異的臨床表現(xiàn)與組織學、解剖學、生物學特征。因其病理類型多為腺癌，放療治療效果不理想。食管癌也是人類常見的消化道惡性腫瘤之一，全世界每年新增患者超過30萬人，其發(fā)病率和死亡率各國差異很大，其中發(fā)展中國家比例較高。食管癌的病理類型主要分為鱗狀細胞癌、腺

2、癌、癌肉瘤、肉瘤樣癌以及小細胞癌。我國是世界食管癌高發(fā)地之一，其死亡率占全球的50％以上，粗死亡率為17.38/10萬，占總癌亡人數(shù)的16.41％。鱗狀細胞癌為我國食管癌主要病理學類型，約占發(fā)病率的90％左右。目前，賁門癌和食管癌患者的主要治療手段是手術治療，但患者術后的生存期并不樂觀，其5年生存率都僅為30％左右。賁門癌和食管癌有一些值得注意的病理學和流行病學相似點，如發(fā)病年齡、性別等。在食管癌高發(fā)區(qū)，賁門癌的發(fā)病率也較高，食管癌高發(fā)

3、區(qū)賁門癌發(fā)病率約為50/10萬，是食管癌的2/3，特別是河北省磁縣和涉縣等地區(qū)這一流行病學特征更為突出。因二者有相似的病理學、流行病學等特點，故進一步比較研究同一地區(qū)賁門癌與食管癌發(fā)病的分子學機制，對于尋找新的治療靶點以提高個體化治療效果，具有重要的理論意義和應用價值。
　　BRAF基因，別名鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體(v-rafmurinesarc-omaviraloncogenehomolog B1)，位于染色體7q34由7

4、83個氨基酸組成，能夠編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是RAF家族成員之一，而且還是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信號通路中相當重要的轉(zhuǎn)導因子，調(diào)控多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種人類惡性腫瘤如惡性黑色素瘤、肺癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌中均存在不同比例的BRAF基因突變。當前，在我國關于BRAF基因在賁門癌及食管鱗狀細胞癌組織是否發(fā)生突變的研究鮮有報道。
　　本研究采用基因測序的方法檢

5、測了在人賁門癌、食管鱗狀細胞癌組織及其相對遠癌組織（距癌組織邊緣5cm以上）中BRAF基因第11外顯子及第15外顯子的突變情況，并運用免疫組化方法檢測了賁門癌、食管鱗狀細胞癌組織及相對遠癌組織中BRAF蛋白的表達情況，分析了其與賁門癌及食管鱗狀細胞癌臨床病例特征各指標間的關系，探討了BRAF基因突變在賁門癌及食管鱗狀細胞癌的臨床意義，為今后制備BRAF基因抑制劑、尋找應用于賁門癌及食管鱗狀細胞癌分子靶向治療的新靶點提供理論基礎及實驗依據(jù)

6、。
　　方法:收集河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科在2014年2月-2014年12月期間經(jīng)手術治療的賁門癌、食管鱗狀細胞癌患者新鮮組織標本共91例。其中賁門癌標本46例，食管鱗狀細胞癌標本45例。在賁門癌標本中，男性患者38例，女性患者8例，男女比例為4/1，病人平均年齡為59.8歲，高分化4例，中分化22例，低分化20例。在食管鱗狀細胞癌標本中，男性患者27例，女性患者18例，男女比例為3/2，病人平均年齡為61.3歲，高分化3例，中

7、分化31例，低分化11例。所有患者術前均未進行放療及化療，全部手術切除標本均經(jīng)病理證實。對照組選取這91例患者的新鮮遠癌組織標本（距癌組織邊緣5cm以上）。分別記錄患者性別、年齡、病理類型、分化程度、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病例情況。采用組織全基因組提取、聚合酶鏈式反應(PCR)技術和基因測序方法，檢測實驗組和對照組標本中BRAF基因的突變情況，并運用免疫組化方法檢測了兩種癌組織及相應遠癌組織中BRAF蛋白的表達情況，分析其與賁

8、門癌及食管鱗狀細胞癌臨床病例特征的關系。采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組計數(shù)資料的比較采用四格表資料的卡方檢驗，兩組等級資料的比較采用Mann-whitney U秩和檢驗，檢測結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1、賁門癌、食管鱗狀細胞癌組織中BRAF基因突變檢驗結(jié)果及臨床特點
　　在46例賁門癌組織中檢測到3例存在于BRAF基因第15外顯子突變，其第11外顯子均未見突變。突變類型均

9、為V600E，即基因突變發(fā)生在第15外顯子的第1799個核苷酸，導致其編碼的纈氨酸被谷氨酸取代。在遠癌組織中未檢測到上述突變。免疫組化結(jié)果顯示3例BRAF基因突變的賁門癌組織陽性表達BRAF蛋白;3例患者均伴有周圍淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，均可見脈管瘤栓，TNM分期分別ⅢB、ⅢB、ⅢC期，分化程度分別為Ⅱ級、Ⅱ級、Ⅲ級，患者性別均為男性，年齡分別是59歲，68歲與55歲。
　　在45例食管鱗狀細胞癌組織中未檢測到BRAF基因第11外顯子和第1

10、5外顯子存在突變。測序結(jié)果顯示，有4個樣品在第11外顯子上增加了一個堿基C或T，即會造成密碼子移碼突變，結(jié)合免疫組化結(jié)果顯示該標本BRAF蛋白陽性表達，考慮該結(jié)果可能為測序誤差所致。
　　2、賁門癌、食管鱗狀細胞癌組織中BRAF蛋白表達及臨床病例特征之間的關系
　　免疫組化結(jié)果顯示在46例賁門癌組織標本中，22例賁門癌細胞中可見分布于腫瘤細胞胞漿中的棕色顆粒，BRAF蛋白表達呈陽性，表達陽性率為47.82％;在相應遠癌組織中

11、僅3例出現(xiàn)棕色顆粒，表達陽性率為6.52％。統(tǒng)計學分析顯示，兩者具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　在45例食管鱗狀細胞癌組織標本中，28例食管鱗狀細胞癌組織BRAF蛋白表達呈陽性，表達陽性率為62.22％;在相應遠癌組織中僅4例出現(xiàn)棕色顆粒，表達陽性率為8.89％。統(tǒng)計學分析顯示，兩者具有顯著性差異(P＜0.05）。
　　本研究顯示46例賁門癌組織中BRAF蛋白陽性表達共22例，總的陽性率為47.82％。男性陽性率50.

12、0％，女性陽性率37.5％;年齡60歲以上（包括60歲）患者陽性率60.0％，60歲以下患者陽性率38.5％;低分化者陽性率40.0％，中分化者陽性率59.1％，高分化者陽性率25.0％;Ⅰ期患者陽性率18.2％，Ⅱ期患者陽性率33.3％，Ⅲ期患者陽性率75.0％;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率62.5％，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率14.3％。統(tǒng)計學分析顯示，BRAF蛋白的表達陽性與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(x2=9.073，P＜0.05)及TNM分期(Z=

13、-3.242，P＜0.05)有關，與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無關。
　　45例食管鱗狀細胞癌組織中BRAF蛋白陽性表達共28例，總陽性率為62.22％。分布為:男性陽性率55.6％，女性陽性率72.2％;年齡60歲以上（包括60歲）患者陽性率53.6％，60歲以下患者陽性率76.5％;低分化者陽性率72.7％，中分化者陽性率54.8％，高分化者陽性率100.0％;Ⅰ期患者陽性率21.4％，Ⅱ期患者陽性率50.0％，Ⅲ期患者陽性

14、率88.2％;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率82.6％，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率40.9％。統(tǒng)計學分析顯示，BRAF蛋白的表達陽性與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(x2=8.318，P＜0.05)及TNM分期(Z=-3.718，P＜0.05)有關，與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無關。
　　結(jié)論:
　　1、本實驗結(jié)果提示BRAF基因突變在賁門癌的發(fā)展中具有一定作用，可能是賁門癌生存不良的新預測因素，可望作為賁門癌的分子靶向治療新的目的基因。而BRAF基