痢疾桿菌效應(yīng)蛋白調(diào)節(jié)宿主蛋白質(zhì)泛素化信號途徑的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、痢疾桿菌是細(xì)菌性痢疾的病原菌，它能夠利用自身毒性質(zhì)粒編碼的三型分泌系統(tǒng)向宿主細(xì)胞內(nèi)分泌效應(yīng)蛋白。效應(yīng)蛋白以宿主細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號分子為靶標(biāo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，以利于痢疾桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖轉(zhuǎn)移。蛋白質(zhì)泛素化途徑是細(xì)胞內(nèi)極其重要的一個翻譯后修飾途徑，因此也常常被效應(yīng)蛋白作為攻擊目標(biāo)。本文以痢疾桿菌效應(yīng)蛋白OspI和IpaH3為研究對象，利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法，解析效應(yīng)蛋白調(diào)節(jié)宿主泛素化過程的分子機(jī)制。已有研究發(fā)現(xiàn)痢疾桿菌效應(yīng)蛋白OspI能

2、夠使Ubc13的Gln100脫酰胺化，導(dǎo)致Ubc13失活，破壞了宿主細(xì)胞內(nèi)的NF-kB信號通路。IpaH3作為一個泛素連接酶，能夠特異地結(jié)合共價連接有泛素的UbcH5c，在下游底物上連接形成K48的泛素鏈。但是，OspI-Ubc13與IpaH-UbcH5c間相互作用的分子機(jī)制仍是一個未解之謎。
　　本文通過原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了OspI及其宿主靶分子泛素結(jié)合酶Ubc13，并通過純化獲得二者的高純度重組蛋白，二者經(jīng)孵育后形成穩(wěn)定的效

3、應(yīng)蛋白-宿主靶分子復(fù)合物。通過復(fù)合物結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，我們獲得了衍射分辨率為2.3埃的復(fù)合物晶體。通過結(jié)構(gòu)分析，我們發(fā)現(xiàn)OspI通過兩個不同的表面電荷區(qū)與Ubc13的α1-螺旋、L1 loop和L2 loop相互作用，也進(jìn)一步揭示了OspI的脫酰胺酶催化機(jī)制。
　　另外，我們通過原核表達(dá)系統(tǒng)，高效表達(dá)和純化獲得了IpaH3的重組蛋白，并且成功地在體外合成了Ub共價連接的泛素結(jié)合酶UbcH5c(UbcH5c～Ub)。然后，我們利用分子篩證明