凋亡及自噬在HVJ-E致A549和A549-DDP細胞死亡中的作用機制.pdf

1、肺癌是當今世界最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率都有明顯升高的趨勢，肺癌是一種多因素的疾病，吸煙是引起肺癌的主要因素之一。目前肺癌的治療主要以手術治療、化學治療和放射治療為主，但存活率普遍不高，所以，我們仍需尋求一種新的方法來治療肺癌。研究表明，滅活的仙臺病毒(Hemaglutinating virus of Japan Envelope，HVJ-E)不僅可以作為載體傳遞抗腫瘤藥物，激活多重抗腫瘤免疫，同時還能直接殺傷腫瘤。在本研究

2、中，我們發(fā)現HVJ-E可直接誘導人肺腺癌細胞(A549)、耐順鉑人肺腺癌細胞(A549/DDP)死亡，并初步探討其抗腫瘤機制。
　　首先，我們通過實驗觀察HVJ-E作用A549、A549/DDP細胞后，RIG-Ⅰ和IFN-β的表達情況。Western Blot和ELISA檢測顯示，經HVJ-E刺激后，RIG-Ⅰ的表達量增加，誘導IFN-β的產生，并呈劑量-效應關系。這表明HVJ-E與A549、A549/DDP細胞發(fā)生了融合，斷裂的

3、病毒基因組被RIG-Ⅰ識別，從而導致A549、A549/DDP細胞中的IFN-β含量隨HVJ-E濃度的增加而增加。
　　其次，我們探索HVJ-E對A549、A549/DDP細胞繁殖和生長的影響。用HVJ-E處理A549、A549/DDP細胞，倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現兩種細胞均出現生長停滯、皺縮和破裂的現象，同時用Hoechst33258染色試劑盒可以觀察到細胞染色質皺縮，細胞核碎裂。CCK-8檢測結果顯示，用100～800 MOI

4、HVJ-E分別處理A549、A549/DDP細胞24小時后，細胞的活力與對照組相比明顯下降，并呈劑量依賴關系。流式細胞術FACS法檢測顯示，經HVJ-E處理后，A549、A549/DDP細胞均產生明顯的凋亡，且呈劑量依賴關系。由此可以說明HVJ-E可以直接導致A549、A549/DDP細胞凋亡。
　　然后，我們用Western Blot法檢測p53、Bcl-2/Bax、Caspase信號通路的相關蛋白。p53的表達量隨HVJ-E濃

5、度增加有升高趨勢，Bcl-2/Bax卻呈下降趨勢，caspase-8、caspase-9、caspase-3、PARP、Caspase-8、Caspase-9隨HVJ-E濃度升高而活性升高，最終都可檢測到碎裂的形式。為進一步確認HVJ-E誘導的A549、A549/DDP細胞凋亡是否與Caspase通路有關，我們用caspase廣譜抑制劑Z-VAD-FMK分別預處理細胞后加HVJ-E處理，結果顯示，碎裂的caspase-3和PARP被顯著

6、抑制且細胞凋亡率也被顯著抑制。該實驗證明Caspase信號通路參與HVJ-E誘導的A549、A549/DDP細胞凋亡。
　　接著，我們研究了MAPK通路是否參與HVJ-E誘導的A549、A549/DDP細胞凋亡。Western Blot法檢測p-p38、p-JNK、p-ERK1/2，結果p38、JNK、ERK1/2均被激活。為進一步確認MAPK通路對細胞凋亡的影響，我們分別利用p38抑制劑SB203580(10μM)、JNK抑制劑

7、SP600125(A549:8μM、A549/DDP:10μM)、ERK抑制劑PD98059（20μM）預處理細胞30分鐘后再加HVJ-E，Western Blot結果顯示p38、JNK、ERK1/2磷酸化均被明顯抑制，同時用CCK-8測定的細胞活力顯示，SB203580、SP600125、PD98059均可以提高細胞活力。以上結果表面MAPK通路在HVJ-E誘導的A549、A549/DDP細胞凋亡中發(fā)揮作用。
　　最后，我們研究

8、了自噬在HVJ-E引起A549、A549/DDP細胞死亡中的作用，我們利用GFP-LC3質粒和Lipofectamine2000轉染A549、A549/DDP細胞，分別設陰性對照組、800 MOI HVJ-E、Rapa組，24小時后倒置熒光顯微鏡下觀察自噬現象。結果顯示，Rapa組出現大量自噬小體，HVJ-E處理組出現少量自噬小體。再用Western Blot法檢測自噬相關蛋白的表達情況，結果顯示p-mTOR、p-p70S6K的表達量均

9、隨著HVJ-E濃度的增加而減小。由此說明自噬參與了HVJ-E促進細胞的死亡。再利用Rapa和CQ分別預刺激A549、A549/DDP細胞，Western Blot法檢測可發(fā)現A549細胞，與HVJ-E組對照組相比，CQ組cleaved caspase-3和cleaved PARP的表達量明顯升高，Rapa組降低，而A549/DDP細胞的結果正好相反。CCK-8測定每組細胞的活力，結果顯示，A549細胞，CQ組的細胞死亡率最高;A549/