重組大腸桿菌右旋糖酐蔗糖酶表達條件優(yōu)化及其催化合成右旋糖酐的研究.pdf

1、右旋糖酐蔗糖酶(EC.2.4.1.5)能以蔗糖為底物，將D-葡萄糖基轉移到正在增長的葡聚糖鏈上形成高分子的葡萄糖聚合物右旋糖酐。右旋糖酐在醫(yī)藥、化工、食品工業(yè)中都有重要的用途。工業(yè)生產(chǎn)右旋糖酐是發(fā)酵腸膜狀明串珠菌，通過加入蔗糖誘導產(chǎn)生右旋糖酐蔗糖酶。因為在原菌株中分離該酶比較困難不利于研究該酶的催化性質，本實驗將右旋糖酐基因克隆到大腸桿菌中并表達。 本研究分別以IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和乳糖為誘導物，通過設計正交

2、實驗，考察培養(yǎng)基中各成分及其濃度對誘導產(chǎn)酶結果的影響，成功選擇了適合不同誘導物可高效表達該酶的兩種表達培養(yǎng)基。在選擇了合適的培養(yǎng)基之后，分別研究誘導條件的影響。用IPTG誘導時，其最佳條件為37℃菌濃達到2.0時，加入IPTG至0.25mmol/L繼續(xù)誘導培養(yǎng)4h。用乳糖誘導時，其最佳條件為菌濃3.0，加入乳糖至1.0％繼續(xù)誘導培養(yǎng)6h。從結果來看，乳糖誘導效果不及IPTG的五分之一，但是對于工業(yè)生產(chǎn)乳糖誘導的低價和無毒則更有價值。

3、 工程菌經(jīng)過IPTG誘導后生產(chǎn)含His-tag融合蛋白的右旋糖酐蔗糖酶，通過硫酸銨沉淀、Ni-NTA親和層析純化，得到純度較高的酶蛋白，并對純酶進行了酶學性質及動力學研究。經(jīng)過SDS-PAGE測得該酶的分子量約為170 kDa，與理論推測值基本相同。以蔗糖為底物，酶促反應的最適溫度為25～30℃，最適pH值為5.4，動力學常數(shù)Km值為10.43 mmol/L；酶活在pH5.0～8.0較為穩(wěn)定，在室溫(25℃)保藏4天仍有59％的酶活

4、力，4℃保存7周酶活力僅下降一半，但在35℃以上失活很快；0.5mol/L Ca2+對催化作用有較大的促進，1.0mmol/L Mg2+有微弱的促進作用，Cu2+和SDS的抑制作用最強。 研究利用表達的重組右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖為底物合成右旋糖酐，探討溫度、蔗糖濃度和pH值對合成糖酐的影響。結果表明，底物轉化率超過80％，合成的糖酐多為大分子但溶解性很好。蔗糖濃度對右旋糖酐產(chǎn)率的影響最大，其次是溫度，影響最小的是pH值。研究對該酶