索科線蟲SAFLP親緣關系分析及長PCR技術在其線粒體全基因組測序中應用.pdf

1、索科線蟲(Mermithidae)是一類寶貴的生防資源，某些屬級的分類目前還存在一些爭議，研究索科線蟲的遺傳背景，正確鑒定線蟲種類或品系，分析不同種類線蟲之間的親緣關系，對于線蟲的實際應用具有十分重要的意義。 SAFLP已經(jīng)在分類、基因組分析、指紋圖譜構建、遺傳穩(wěn)定性、親緣關系的鑒定、分子標記的篩選和基因組DNA多態(tài)性分析等方面廣泛應用。本實驗首次將SAFLP技術應用于昆蟲病原索科線蟲親緣關系研究，建立并優(yōu)化了索科線蟲SAFLP

2、體系，構建了我國常見索科線蟲6屬10余種/亞種的指紋圖譜。采用EcoR I和MseI兩種限制性內(nèi)切酶單酶切，結果顯示EcoR I酶更適合作為索科線蟲SAFLP的內(nèi)切酶。3個帶有3個選擇性堿基的EcoR I引物進行擴增共得條帶225個，片段大小為250～1650bp。通過NTsys-PC2.1軟件計算了6屬11種/亞種索科線蟲的Nei-Li遺傳距離(0.1980～0.4554)和相似系數(shù)，利用NTsys-PC2.1軟件中的UPGMA方法構

3、建這其聚類圖。6屬11種/亞種索科線蟲從屬級階元可以分為兩大類群：羅索屬(Romanomermis)和八腱索屬(Octomyomermis)聚為一支構成第一大類群；六索屬(Hexamermis)與卵索屬(Ovomermis)先聚在一起然后與多索屬(Agamermis)聚在一起，再與兩索屬(Amphimermis)聚在一起構成第二大類群。在八腱索屬和兩索屬中屬內(nèi)不同種/亞種間線蟲采集地相距較近的其遺傳距離較近。在八腱索屬中：Octomyo

4、mermis sp．A+(O. huazhongensis+Octomyomermis sp．C)，在兩索屬中：(Amphimermis sp．B+Amphimermis sp．A)+Amphimermis sp．C。優(yōu)化的索科線蟲SAFLP體系能夠反映索科線蟲種屬間的親緣關系，并與形態(tài)學的研究結果基本相符，可以用于屬種的分類和親緣關系的研究。 線蟲線粒體全基因組對線粒體基因組的進化，線蟲系統(tǒng)發(fā)育、種類鑒定、分子分類，以及線粒體

5、突變相關疾病和細胞衰老、細胞凋亡等方面具有重要的研究意義。目前，國外僅對6種索科線蟲線蟲(Romanomermis culicivorax、R.．iyengan、R．nielseni、Thaumamermis cosgrovci、Agamermis sp．、Hexamermis agrotis)線粒體全基因組進行了研究，國內(nèi)此領域還屬空白。 本實驗首次應用長PCR技術展開了我國索科線蟲線粒體全基因組的初步研究。在前人研究基礎上，

6、設計出一套適合中華卵索線蟲(Ovomermis sinensis)線粒體基因組研究的實驗方案。 通過已經(jīng)測序的線蟲線粒體基因序列設計出一對引物，擴增出中華卵索線蟲線粒體基因組中4.4 Kb的片段，測序后根據(jù)這一片段中所包含的細胞色素b基因，設計一對引物擴增出剩下的中華卵索線蟲線粒體基因，約23 Kb。采用步移法對兩個片段進行測序。兩個片段間存在較大重復區(qū)域，根據(jù)重復區(qū)進行拼接得到中華卵索線蟲線粒體全基因組。本研究從實驗方法上初步