白木香離體根培養(yǎng)條件優(yōu)化及2-(2-苯乙基)色酮類物質(zhì)誘導.pdf

1、沉香為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)以及擬沉香屬(Gyrinops)喬木的樹脂心材，是貴重香料和傳統(tǒng)藥材，目前正面臨著野生資源枯竭和人工生產(chǎn)低效等問題。沉香主要含倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮等特征成分，研究這些成分的代謝調(diào)控，有助于闡明沉香的形成機制。離體根培養(yǎng)體系已經(jīng)成功用于人參、丹參活性物質(zhì)的代謝途徑研究。效法成功案例，離體根培養(yǎng)體系可望成為研究沉香特征成分合成代謝的有效途徑。白木香(Aquila

2、ria sinensis(Lour.) Gilg)為國產(chǎn)沉香的唯一植物來源，其離體根系體系已有文獻報道。本研究擬進一步對離體根培養(yǎng)過程中的多個重要因素進行系統(tǒng)考察，建立穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，為后續(xù)研究沉香倍半萜和色酮類物質(zhì)的合成奠定基礎(chǔ)。
　　1目的:
　　本研究以白木香無菌苗根為供體材料，建立穩(wěn)定、高效的離體根培養(yǎng)體系;并進行2-（2-苯乙基）色酮類結(jié)香標志物的誘導。
　　2方法:
　　2.1優(yōu)化白木香離體根培養(yǎng)體系

3、
　　以白木香離體根為材料，分別考察生長素的種類與濃度、生長素處理時間、無機鹽濃度和初始接種量等對白木香離體根誘導生長的影響，以出根率、側(cè)根密度和側(cè)根長為指標，篩選出最佳的白木香離體根培養(yǎng)體系。并在此基礎(chǔ)上，觀察單代白木香離體根生長曲線變化情況。
　　2.2白木香離體根連續(xù)繼代培養(yǎng)考察
　　以白木香離體根為材料，在原有的培養(yǎng)條件上，觀察連續(xù)繼代對白木香離體根再生和側(cè)根生長的影響;以出根率、側(cè)根密度和側(cè)根粗細為指標，考察

4、白木香離體根連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定性。
　　2.3茉莉酸甲酯(MeJA)刺激白木香離體根實驗
　　以培養(yǎng)了35d的白木香離體根為材料，用添加MeJA的培養(yǎng)基培養(yǎng)根系。通過觀察離體根系的再生率和側(cè)根生長情況，觀察MeJA對白木香根系再生的影響。利用氣質(zhì)聯(lián)用色譜法(GC-MS)檢測其中色酮類物質(zhì)，考察MeJA濃度和處理時間對白木香根系產(chǎn)生色酮類物質(zhì)的影響。
　　3結(jié)果:
　　3.1白木香離體根培養(yǎng)體系
　　單因素法優(yōu)化

5、白木香離體根培養(yǎng)條件，結(jié)果表明:IBA1.5 mg/L誘導7d可生成大量生長良好的側(cè)根;MS培養(yǎng)基減量濃度(1/4、1/2、3/4×MS)有利于側(cè)根誘導，正常濃度(1×MS)有利于側(cè)根生長;每瓶接種15根為最佳初始接種量。離體根發(fā)育進程觀測結(jié)果表明，第6天多數(shù)離體根中形成側(cè)根原基，第9天少數(shù)離體根的側(cè)根原基發(fā)育突破主根表皮，隨后側(cè)根迅速生長，離體根系干重增殖系數(shù)到第21天達到最大值，之后逐步下降。
　　3.2白木香離體根連續(xù)繼代培

6、養(yǎng)中根系再生情況
　　用水合氯醛浸泡白木香離體根24 h后觀察，可清晰觀察到離體根中的側(cè)根原基。研究結(jié)果表明，在連續(xù)6代培養(yǎng)中白木香離體根經(jīng)IBA誘導后側(cè)根原基的生長曲線變化趨勢一致，但連續(xù)繼代會影響側(cè)根密度。白木香離體根再生能力在連續(xù)繼代培養(yǎng)過程中前3代側(cè)根密度保持穩(wěn)定，在第4代時側(cè)根密度迅速增加，在第5代又恢復到與前三代相同水平。最終各代主根段上可穩(wěn)定形成12-18條側(cè)根。此外，連續(xù)培養(yǎng)過程中側(cè)根直徑隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加而逐漸變

7、小。
　　3.3白木香離體根系對MeJA刺激的反應
　　隨著MeJA濃度的升高，白木香離體根的生根率降低。不同濃度會對側(cè)根生長有不同效應，高濃度(400μmol/L)抑制白木香側(cè)根生長;中濃度(100、200μmol/L)會一定程度限制側(cè)根密度，促進側(cè)根伸長;低濃度(50μmol/L)的MeJA刺激會使側(cè)根密度增多和促進側(cè)根伸長。
　　GC-MS結(jié)果表明，MeJA可誘導白木香離體根系產(chǎn)生2-（2-苯乙基）色酮類物質(zhì)。G

8、C-MS結(jié)果表明白木香根系產(chǎn)生2-（2-苯乙基）色酮類物質(zhì)的種類與外源MeJA處理濃度和處理時間呈正相關(guān)。隨著MeJA處理時間為(0、1、3、5、7d)的增加，可檢測到的2-（2-苯乙基）色酮類物種從0種到2種;隨著MeJA處理濃度（0、50、100、400μmol/L）的增加，可檢測的2-（2-苯乙基）色酮類物質(zhì)從1種到3種。
　　4.結(jié)論:
　　本研究優(yōu)化了白木香離體根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，明確了連續(xù)繼代根系的穩(wěn)定性，建立了一