低濃度H-,2-O-,2-促進兔角膜培養(yǎng)上皮細胞黏附及移行的離體實驗研究.pdf

1、目的：細胞黏附及移行是角膜上皮創(chuàng)傷愈合的關鍵步驟，該過程依賴于整合素(integrin)及其配體纖維連接素(fibronectin)的信號作用系統(tǒng)。在細胞黏附于細胞外基質(zhì)的過程中，活性氧(Reaciveoxygenspecies，ROS)是整合素信號系統(tǒng)所必需的胞內(nèi)產(chǎn)物。本研究旨在通過體外實驗觀察外源性低濃度過氧化氫(hydrogenperoxide，H2O2)對兔培養(yǎng)角膜上皮細胞黏附及移行作用。 方法：采取新西蘭大白兔的角膜緣

2、作為原代細胞培養(yǎng)的組織片。除培養(yǎng)細胞外，本研究實驗均使用無生長因子以及無血清的培養(yǎng)液。四甲基偶氮比色(measurementoftrititaedthymidineincorporation，MTT)細胞活力測試法用于檢測外源性H2O2(0.1，5，10，20，50，60，和70μM)作用兔角膜上皮細胞2小時及24小時后的細胞活性。在適宜H2O2濃度范圍內(nèi)，黏附離心法用于測試黏附30和60分鐘后的細胞數(shù)量。在此基礎上，進一步用抗氧化劑N

3、-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)作為外源性H2O2拮抗藥，再測試黏附細胞的數(shù)量。選取最佳H2O2濃度組與非H2O2處理組，拍照記錄兩組細胞黏附15，30，以及60分鐘時的細胞形態(tài)，以比較兩組的變化差異。免疫熒光法被用于以上兩組細胞在30分鐘時的黏著斑蛋白(vinculin)，以及絲狀肌動蛋白(F-actin)表達的測定。離體創(chuàng)傷愈合實驗證明外源性低濃度H2O2對培養(yǎng)的細胞移行，以及創(chuàng)傷愈合的作用。

4、 結(jié)果：本研究的所有實驗取用原代培養(yǎng)的兔角膜上皮細胞第2～3代。低于50μM的外源性H2O2作用細胞2小時及24小時，不降低細胞活性；而70μMH2O2則顯著性地下降細胞活性(p＜0.05)。黏附離心法結(jié)果顯示，低濃度H2O2對細胞黏附30和60分鐘時的促進作用具有明顯的劑量依賴關系：5～50μMH2O2顯著性地促進細胞黏附(p＜0.05)，其中20μM是促進的峰值；而60μMH2O2抑制細胞黏附(p＜0.08)；NAC可顯著性地拮抗2

5、0μMH2O2對細胞黏附的促進作用(p＜0.05)。細胞黏附形態(tài)學觀察顯示20μMH2O2較0μMH2O2組的細胞更早表現(xiàn)出細胞邊緣波紋狀皺折，偽足伸出和梭形伸展的極性形態(tài)。免疫熒光法顯示在細胞黏附30分鐘時，20μMH2O2組細胞表達點狀的黏著斑蛋白，以及絲束狀肌動蛋白；而未經(jīng)H2O2處理的細胞則尚未表達。離體兔角膜上皮創(chuàng)傷愈合實驗顯示：外源性低濃度H2O2(10μM～50μM)顯著性地促進細胞移行和創(chuàng)傷愈合(p＜0.01)；其中20