菹草類胡蘿卜素的結構鑒定、分類及生物活性研究.pdf

1、菹草(Potamogeton crispus L.)是一種多年生沉水維管束植物，分布十分廣泛。廣大湖區(qū)的蛋鴨采食菹草后能產(chǎn)下優(yōu)質(zhì)的紅心鴨蛋。已有研究表明，蛋黃色澤與飼料中類胡蘿卜素的種類和含量密切相關。本研究室研究結果揭示，菹草中含有大量的類胡蘿卜素，它不僅能加深蛋黃色澤，同時關于它的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等生物活性更是成為當今研究的熱點之一。菹草作為一種新的類胡蘿卜素資源，無論是其類胡蘿卜素的結構分類研究、還是生物活性的系統(tǒng)探討以及

2、資源的深度開發(fā)利用均鮮見報道，因此深入研究菹草中類胡蘿卜素將對菹草資源的開發(fā)利用具有重要的戰(zhàn)略意義。 本課題綜合運用了色譜及波譜等現(xiàn)代儀器手段和化學分析方法，對菹草中類胡蘿卜素的結構進行了分類研究，同時采用生物學前沿技術和手段，探討了菹草類胡蘿卜素的抗氧化活性及體內(nèi)外抗腫瘤的作用與機制。研究結果如下： 1.菹草類胡蘿卜素的結構鑒定與分類 采用有機溶劑石油醚：丙酮(1：1，v/v)提取菹草中類胡蘿卜素，通過完全皂化

3、處理得到菹草總類胡蘿卜素TCPC。采用柱層析和薄層層析對TCPC進行分離純化，得到組分y<,1>，y<,2>，y<,3>和y<,4>。為鑒定菹草類胡蘿卜素y<,1>、y<,2>、y<,3>和y<,4>的化學結構，本文系統(tǒng)運用了色譜、波譜技術，結合化學分類反應，鑒定y<,1>，y<,2>，y<,3>和y<,4>分別為新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素和β-胡蘿卜素(菹草中紅色素已由本實驗室上屆博士生鑒定為紫杉紫素的順反異構體)。菹草中含有胡蘿卜素和葉

4、黃素兩大類類胡蘿卜素，主要為新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素、紫杉紫素和β-胡蘿卜素等五種類胡蘿卜素。 本文采用分光光度法測定了菹草中類胡蘿卜素總含量(以干基計算)為230.8μg/g。用HPLC法測定了菹草中各種類胡蘿卜素的相對含量(以干基計算)：菹草中β-胡蘿卜素的含量為80.2μg/g；新黃質(zhì)的含量為2.4μg/g：紫黃質(zhì)的含量為24.8μg/g；葉黃素的含量為84.4μg/g；紫杉紫素的含量為36.0μg/g。 2.菹草類

5、胡蘿卜素的生物活性 本文研究了菹草總類胡蘿卜素TCPC和菹草紫杉紫素RPC的體外抗氧化能力，并從免疫學和細胞凋亡角度對菹草類胡蘿卜素的抗癌活性進行了研究，探討了類胡蘿卜素抗癌的作用機理。 (1)菹草類胡蘿卜素體外抗氧化活性研究本實驗通過對羥自由基、紅細胞溶血、肝臟與肝線粒體中的脂質(zhì)過氧化以及肝線粒體腫脹度的測定，結果發(fā)現(xiàn)菹草總類胡蘿卜素TCPC能夠有效地清除羥自由基，抑制由羥自由基引起的脂質(zhì)過氧化，保護生物膜，減少紅細胞

6、溶血，減輕肝線粒體腫脹程度，提示TCPC具有很強的抗氧化能力。 通過對TCPC和RPC在油脂中的抗氧化作用研究，結果發(fā)現(xiàn)在油脂自動氧化實驗中單獨使用RPC無抗氧化作用，而使用TCPC具有抗氧化作用。TCPC和RPC對VC的抗油脂氧化性能均有一定的協(xié)同增效作用，且TCPC的增效作用比RPC強。油脂光敏氧化實驗結果表明，TCPC和RPC均可抑制由亞甲基藍所引發(fā)的油脂光敏氧化，且抑制效果隨著類胡蘿卜素濃度的升高而增強。 (2)

7、TCPC對H<,22>荷瘤小鼠的抗腫瘤作用研究以肝癌H<,22>荷瘤小鼠為模型，分別灌胃5mg/kg.d、10mg/kg.d和20mg/kg.d TCPC10d后均可顯著抑制腫瘤的生長，其抑瘤率分別為37.4％，50.7％，52.3％；TCPC各劑量組均能顯著提高荷瘤小鼠遲發(fā)型超敏反應的強度，促進T淋巴細胞增殖和NK細胞活性；增強肝臟中SOD的活性，降低MDA的含量；TCPC還可誘導小鼠肝癌細胞發(fā)生凋亡，將腫瘤細胞的細胞周期阻滯于G0/

8、G1期。結果提示TCPC抗腫瘤的作用機理可能涉及到對機體免疫功能的調(diào)節(jié)、抗氧化作用以及誘導癌細胞發(fā)生凋亡，改變細胞周期等方面。 (3)TCPC和RPC誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡的研究首次提出TCPC 和RPC誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡是類胡蘿卜素抗腫瘤活性的作用機制之一。其凋亡機制可能與改變細胞周期、降低線粒體跨膜電位、增加胞內(nèi)鈣離子濃度、增強iNOS活性，升高NO濃度等方面有關。MTT實驗發(fā)現(xiàn)2.5～10μg/mL TCP

9、C和5～20μg/mL RPC對Hela細胞的生長有顯著的抑制作用，且具有時間-效應和劑量-效應關系。采用倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、透射電鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到。TCPC和RPC作用4d后的Hela細胞呈典型的凋亡形態(tài)。與對照組比較，流式細胞儀檢測到TCPC和RPC作用Hela細胞后使其細胞周期發(fā)生改變，線粒體跨膜電位降低。激光掃描共聚焦顯微鏡檢測經(jīng)TCPC和RPC處理4d后的細胞胞內(nèi)Ca<'2+>濃度顯著升高。TCPC和RPC還