SET8在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其沉默后對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：腎癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2~3％，其中腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）約占70%。RCC患者起病隱匿，確診時(shí)20%~30%的患者已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。RCC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段和多基因參與的生物學(xué)過程，但臨床上對(duì)其發(fā)生、發(fā)展一直缺乏有效的檢測(cè)與治療方法。SET8是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)唯一能夠特異性單甲基化組蛋

2、白 H4賴氨酸20位（Histone H4 lysine20，H4K20）的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，參與調(diào)控細(xì)胞周期、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及基因轉(zhuǎn)錄。近年來，其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中所起的作用備受關(guān)注。SET8在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并參與調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，臨床研究發(fā)現(xiàn)SET8表達(dá)水平影響肝癌、非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后，提示SET8在腫瘤發(fā)生及侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但目前對(duì)于SET8基因及其蛋白表達(dá)在ccRCC發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚，因此本研

3、究旨在探討SET8表達(dá)水平與ccRCC患者臨床病理特征的關(guān)系，通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)明確SET8對(duì)ccRCC786-O細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的影響及其可能機(jī)制。
　　方法：
　　1、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ccRCC組織標(biāo)本SET8蛋白表達(dá)情況及其與ccRCC患者臨床病理特征的關(guān)系。
　　2、體外培養(yǎng)ccRCC786-O細(xì)胞，針對(duì)人SET8基因設(shè)計(jì)合成4對(duì)候選短發(fā)夾RNA（shRNA）序列(shRNA1，shRNA2，shRNA3，shR

4、NA4)，以lipofectamine2000為載體，轉(zhuǎn)染ccRCC786-O細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，Western blot檢測(cè)786-O細(xì)胞SET8蛋白的表達(dá)，篩選有效shRNA序列。將有效 shRNA序列轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞，細(xì)胞分3組：（1） SET8-shRNA轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染 SET8-shRNA)；（2）陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA）；(3)正常對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）。
　　3、MTT法檢測(cè)786-O細(xì)胞增殖

5、能力；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)786-O細(xì)胞遷移能力；Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)786-O細(xì)胞侵襲能力。
　　4、RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞wnt通路相關(guān)基因β-catenin、c-myc、MMP7 mRNA表達(dá)情況。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，SET8蛋白表達(dá)水平與ccRCC患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)比較采用t檢

6、驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.SET8蛋白表達(dá)與ccRCC患者臨床病理特征的關(guān)系：156例ccRCC組織中，SET8蛋白陽性表達(dá)154例，占98.7%(154/156)；SET8蛋白高表達(dá)者94例，占60.3%(94/156)，低表達(dá)者為62例，占39.7%(62/156)。SET8蛋白表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切（均 P<0.05），但與 ccRCC患者的性別、

7、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P>0.05）；2.RNA干擾技術(shù)沉默 SET8在786-O細(xì)胞中的表達(dá)：在SET8-shRNA濃度為2ug/L、lipofectamine2000為4ul/孔轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染效率約70%；篩選最佳干擾序列為SET8-shRNA2，轉(zhuǎn)染48h沉默效率可達(dá)64%。SET8-shRNA2轉(zhuǎn)染組SET8蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)染后48h顯著低于陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組、正常對(duì)照組（t=-38.174，P<0.01；t=-58.766，P<0.0

8、1）；3.SET8基因沉默抑制786-O細(xì)胞增殖和克隆形成能力：MTT結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組和正常對(duì)照組相比，SET8-shRNA2轉(zhuǎn)染組MTT吸光度值在轉(zhuǎn)染后24、48h明顯下降（均P<0.05）。SET8-shRNA組的克隆形成數(shù)目顯著低于陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組和正常對(duì)照組（均P<0.05），且克隆體積亦較小，而后兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；4.SET8基因沉默抑制786-O細(xì)胞遷移侵襲能力：沉默SET8基因后ccRCC細(xì)胞劃

9、痕愈合速度明顯慢于陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組和正常對(duì)照組（均 P<0.05）,SET8-shRNA組細(xì)胞遷移抑制率為66.7%，癌細(xì)胞遷移率明顯減低。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組、正常對(duì)照組相比，SET8基因沉默后786-O細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低（P<0.05）；5.SET8基因沉默抑制wnt信號(hào)通路相關(guān)基因c-myc、MMP7 mRNA的表達(dá)：與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組、正常對(duì)照組相比，沉默 SET8基因表達(dá)后，wnt靶基因 c-m