建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的細(xì)胞分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究.pdf

1、建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）是侵染蘭花最常見的兩種病毒。它們使蘭花葉片形成褪綠條紋、凹陷的灰白斑或壞死圈斑等癥狀，導(dǎo)致植株生長不良、開花小而少，花期縮短，給花卉生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。CymMV隸屬線形病毒科（Flexiviridae）、馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus），病毒RNA基因組全序列約6-7 kb，與

2、該同屬的其它成員有很高的同源性。整個(gè)基因組由5個(gè)開放讀碼框架（ORF）構(gòu)成，其中CP基因是完整地ORF5框，長約700nt，編碼24kD的外殼蛋白。ORSV隸屬煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），病毒RNA基因組全序列約5-6 kb，含有4個(gè)ORF，CP基因是完整的ORF4，長約600nt，編碼17kD的外殼蛋白。
　　通過負(fù)染和超薄切片觀察到蝴蝶蘭（P. amabilis）病葉中線狀和桿狀病毒顆粒。進(jìn)一步的組織切片觀察，同

3、時(shí)發(fā)現(xiàn)兩種病毒的典型聚集體：CymMV呈帶狀聚集體，粒子多層排列，層間成一定角度或螺旋相疊；ORSV聚集體呈平行、角層狀或螺旋型排列。二種病毒聚集體均出現(xiàn)于薄壁細(xì)胞、細(xì)胞間隙和維管束中，感病細(xì)胞中葉綠體發(fā)育不全；線粒體增生、腫脹甚至空化；細(xì)胞核膨大、空化。通過建立多重 RT-PCR體系，同時(shí)擴(kuò)增到建蘭花葉病毒（CymMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）的外殼蛋白基因。經(jīng)序列測定和同源性比對(duì)，與GenBank已知分離物同源性分別達(dá)到98％和9

4、9-100%。從細(xì)胞和分子層面共同揭示了CymMV與ORSV復(fù)合侵染蘭科植物后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變特征。同時(shí)為兩種病毒的復(fù)合侵染提供快速直接的鑒定依據(jù)。
　　用RT-PCR方法獲得了CymMV和ORSV外殼蛋白基因，將兩個(gè)基因片段分別插入原核表達(dá)載體 pET32c，構(gòu)建載體 pET32c-CymMV-CP和pET32c-ORSV-CP并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了重組蛋白表達(dá)，Western blotting分析證實(shí)表

5、達(dá)產(chǎn)物具有免疫反應(yīng)性。根據(jù)Western blot結(jié)果，將含兩種重組質(zhì)粒的重組菌大量表達(dá)，并通過鎳瓊脂糖凝膠純化蛋白，免疫家兔，制備了CymMV和ORSV的多克隆抗體，并通過ELISA測定了抗體效價(jià)。
　　總之，本研究從細(xì)胞層面、分子層面及免疫學(xué)層面對(duì)CymMV和ORSV進(jìn)行了初步研究。探討了感染這兩種病毒的植物組織超微結(jié)構(gòu)病變，建立了多重RT-PCR鑒定體系，為這兩種病毒的快速鑒定提供依據(jù)。原核表達(dá)了病毒外殼蛋白并制備了多克隆抗