miR-152抑制Wnt10b影響人正常肝細胞和人肝癌細胞脂肪變性的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　發(fā)現(xiàn)miR-152在肝細胞脂質(zhì)代謝中的作用;驗證WNT是miR-152靶基因并進一步探討miR-152抑制WNT信號通路促進肝細胞脂肪變性的分子機制。
　　方法
　　首先，利用慢病毒技術，構建miR-152過表達慢病毒和miR-152沉默慢病毒，分別轉染人正常肝細胞和人肝癌細胞中，得到miR-152過表達組細胞(Lenti-miR-152)、miR-152沉默組細胞(Lenti-152-In)和空載對照組細

2、胞(Lenti-NC)，RT-PCR驗證miR-152表達;棕櫚酸和油酸（1mM）干預Lenti-miR-152、Lenti-152-In和Lenti-NC組細胞后，采用油紅O染色和甘油三酯測定試劑盒檢測脂質(zhì)合成情況;同時，通過構建熒光素酶報告基因質(zhì)粒，結合生物信息學分析結果驗證miR-152靶基因;對Lenti-miR-152、Lenti-152-In和Lenti-NC分別在mRNA水平和蛋白水平檢測WNT信號通路以及下游脂質(zhì)合成關鍵

3、轉錄因子的表達水平，探討miR-152通過抑制WNT信號通路促進肝細胞脂肪變性的分子機制。最后分別檢測Lenti-miR-152、Lenti-152-In和Lenti-NC組細胞ATP含量和線粒體拷貝數(shù)，探討miR-152對線粒體功能的調(diào)控作用。
　　結果：
　　RT-PCR驗證miR-152表達證實成功構建miR-152過表達和miR-152沉默肝細胞。油紅O染色結果顯示miR-152促進肝細胞脂滴聚積;miR-152過表

4、達組細胞甘油三酯含量高于空載組;miR-152沉默對肝細胞脂肪代謝影響不大。經(jīng)生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，Wnt10b是miR-152的靶基因，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)結果證實miR-152直接結合于Wnt10b的3'UTR區(qū);同時，Western blot結果顯示miR-152能直接抑制Wnt10b的表達。RT-PCR與Western blot顯示miR-152增加GSK-3β磷酸化水平，促進β-Catenin降解，抑制β-Catenin進入肝