Wnt10b調(diào)控人毛囊生長的分子機制實驗研究.pdf

1、背景：
　　 毛囊是人體內(nèi)結(jié)構(gòu)和細胞成份最復雜的微小器官，其主要功能是形成毛發(fā)組織。胚胎時期毛囊的發(fā)育是神經(jīng)外胚層-中胚層之間相互作用的結(jié)果，主要有三種類型的干細胞作用:上皮、神經(jīng)脊、間充質(zhì)。根據(jù)干細胞的來源，分別分化為上皮系（皮脂腺、分化為內(nèi)外根鞘細胞和毛發(fā)細胞的毛母質(zhì)角質(zhì)細胞），間充質(zhì)系（具有誘導功能的毛乳頭細胞，毛囊結(jié)締組織鞘），而神經(jīng)脊細胞則分化形成能夠產(chǎn)生毛囊色素單位的黑色素細胞。
　　 許多實驗研究顯示:成人

2、毛囊生長的過程與胚胎時期毛囊發(fā)育的形態(tài)發(fā)生非常相似，參與胚胎毛囊發(fā)育的許多分子信號、細胞因子等在成人毛囊的周期性生長過程中同樣具有明顯的表達，誘導胚胎時期毛囊形態(tài)發(fā)生的信號很可能與促進成人毛囊干細胞向毛囊上皮分化的信號相一致。因此，對毛囊的形態(tài)發(fā)生與發(fā)育信號通路的研究，尤其是了解這些信號通路對于成人毛囊周期性生長調(diào)控的分子機制，有助于開發(fā)促進或者抑制毛發(fā)生長的相關(guān)藥物的研究，從而更快更有效地治療脫發(fā)等相關(guān)的毛發(fā)疾病。
　　 在胚

3、胎發(fā)育期間，毛囊的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育依賴于真皮和表皮之間一系列信號分子的調(diào)控，它們介導了兩個不同的細胞群體之間的相互作用，誘導兩種細胞進行有序的增殖和特定的分化，并引導細胞最終分化形成內(nèi)根鞘、外根鞘、毛干，以及毛乳頭。這些信號主要包括了Wnt/Wingless家族、SonicHedgehog(Shh)，以及轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2)、骨形成蛋白家族(BMPs)、成纖維細胞生長因子家族(FGFs)、外胚葉發(fā)育不全基因（Eda/Edar）

4、等。其中，已經(jīng)有許多實驗研究通過基因敲除和轉(zhuǎn)基因的動物模型證實Wnt信號是促進毛囊發(fā)育的關(guān)鍵因素。
　　 Wnt家族蛋白與果蠅Wingless蛋白同源，是一類脂質(zhì)修飾的分泌型糖蛋白家族，通過激活細胞表面的受體介導的信號轉(zhuǎn)導通路來調(diào)控各種細胞功能作用，例如細胞分化的方向、增殖、遷移、極性分布，以及基因的表達。Wnt蛋白不但對胚胎時期的形態(tài)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，而且參與多種成體組織的再生，如皮膚和毛囊組織。當Wnt蛋白位于細胞表面

5、的受體卷曲蛋白(FZ)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6受體（LRP5/6）家族成員相結(jié)合時，能夠激活Wnt經(jīng)典的信號通路。在經(jīng)典的Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路中，卷曲蛋白能夠作用于細胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白(Dishevelled，DVL)，蓬亂蛋白能夠切斷位于細胞質(zhì)的β-catenin的降解途徑，從而促使β-catenin在細胞質(zhì)內(nèi)積累，并進入細胞核，與T細胞因子/淋巴細胞增強因子(T cell factor/lymphoi

6、d enhancer factor，TCF/LEF-1)相互作用;而當Wnt信號不存在時，細胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin很快就被降解。Wnt蛋白通過調(diào)控TCF/LEF-1來調(diào)節(jié)靶基因的表達，對多種靶細胞和組織發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Wnt信號決定了未分化表皮細胞的命運，研究表明在轉(zhuǎn)基因小鼠中，當表皮細胞過表達Wnt信號的抑制劑Dickkopf1(Dkk1)，或者表皮細胞缺少β-catenin時，結(jié)果抑制了毛囊的發(fā)育形成;然而，當表皮細胞過表達

7、β-catenin時，毛囊發(fā)育異常增多。此外，Wnt信號對出生后毛囊毛干的形成亦起到重要的調(diào)控作用，據(jù)Millar et.al研究結(jié)果表明Wnt3和DVL2在小鼠的毛干前體細胞有明顯的表達，當在毛囊的外根鞘中異位表達Wnt3時則導致毛干前體細胞不能成功地分化形成毛干。Kishimoto et.al證實新鮮分離的小鼠毛囊毛乳頭細胞能夠誘導上皮細胞形成新生毛囊，但是將毛乳頭細胞在體外進行傳代培養(yǎng)過程中，細胞逐漸喪失誘導毛囊在生的能力。但是經(jīng)

8、典的Wnt信號能夠維持體外培養(yǎng)的小鼠毛乳頭細胞的誘導能力，說明可能在體內(nèi)毛囊上皮細胞的Wnt信號能夠作用于毛乳頭，從而維持毛乳頭細胞的誘導能力。但是人和小鼠的Wnt家族成員總共達到19種之多，究竟是何種Wnt蛋白成員對出生后的人毛囊生長發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，而其發(fā)揮作用的調(diào)控機制是什么迄今為止尚不明確。
　　 Seshamma Reddy et.al對在小鼠的表皮和真皮組織中可能表達的所有Wnt成員進行了檢測和分析，在小鼠胚胎皮膚

9、和出生后的皮膚中結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt10b和Wnt5a在毛囊的發(fā)育早期特異表達，其中，Wnt10b在胚胎時期皮膚毛囊發(fā)育的啟動和出生后毛囊生長期啟動時表達水平明顯上調(diào)。不僅如此，以動物為模型的實驗結(jié)果顯示，外源性Wnt10b蛋白能夠促進體外培養(yǎng)的小鼠胚胎皮膚毛囊的發(fā)育，在眾多的Wnt家族成員當中，只有Wnt10b具有誘導未成熟表皮細胞向毛干及內(nèi)根鞘細胞分化，并且能夠刺激體外培養(yǎng)的毛囊毛干生長的能力。因此，Wnt10b可能通過促使表皮和（或者）

10、真皮細胞內(nèi)β-catenin在細胞質(zhì)中的積累并向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，啟動相關(guān)靶基因的表達，繼而調(diào)控毛囊的發(fā)育和生長，對其功能的進一步探討研究，將有助于開發(fā)解決毛發(fā)疾病的新的治療方法。
　　 綜上所述，Wnt10b在脂肪、骨骼發(fā)育以及腫瘤等的形成中具有重要的作用，在胚胎時期毛囊發(fā)育過程的基板形成階段，Wnt10b是最早表達和最顯著的標記物之一，說明Wnt10b能夠促進上皮細胞的分化和毛囊早期的發(fā)育。同時Wnt10b能夠在體外促進皮膚上皮

11、細胞向毛囊的毛干和內(nèi)根鞘細胞分化。然而，目前尚無報道研究Wnt10b在人毛囊組織中的表達如何，如果有表達，是通過何種機制作用于人毛囊細胞？比如人毛乳頭細胞，如果Wnt10b能夠作用于人毛乳頭細胞，那么是通過何種途徑實現(xiàn)的？對人毛乳頭細胞的生物效應是增強的，還是抑制的呢？此外，Wnt10b對人毛囊毛干的分化形成作用如何？因此我們探討和研究了Wnt10b調(diào)控人毛囊生長的分子機制。首先我們觀察Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b以及經(jīng)典的Wn

12、t信號通路下游蛋白β-catenin、LEF-1在生長期人毛囊組織中的免疫組化表達情況，檢測上述幾種Wnts蛋白的表達水平;接著探討了人毛乳頭細胞經(jīng)過體外長期的傳代培養(yǎng)后，與誘導毛囊生成能力相關(guān)的細胞特異性標記物堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)和胰島素樣生長因子-1(Insulin-likegrowth factor-1，IGF-1）的表達情況，以及細胞增殖能力的分析，為進一步分析Wnt10b對人毛乳頭細胞

13、毛囊誘導能力以及細胞增殖能力的影響奠定了理論基礎;然后證實在Wnt10b的作用下，體外長期培養(yǎng)后的人毛囊毛乳頭細胞的生物效應以及人毛乳頭細胞增殖情況;最后，我們還初步探討了Wnt10b對生長期人毛囊毛干生長的作用以及分子調(diào)控機制。
　　 第一章、Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b、β-catenin以及LEF-1在人毛囊組織中的表達
　　 目的：觀察Wnt3a、Wnt5a、Wnt10以及經(jīng)典的Wnt信號通路下游蛋白β-

14、catenin、LEF-1在生長期人毛囊組織中的免疫組化表達情況。
　　 方法：
　　 取整形外科除皺手術(shù)的額顳部帶完整毛囊組織的健康頭皮皮膚，將頭皮皮膚組織進行石蠟包埋、切片后，使用免疫組織化學染色方法，觀察Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b以及經(jīng)典的Wnt信號通路下游蛋白β-catenin、LEF-1在生長期的人毛囊組織中的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 Wnt3a、Wnt5a以及Wnt10b在生長

15、期的人毛囊組織中均可見有表達。Wnt3a在人毛囊的外根鞘、內(nèi)根鞘、毛母質(zhì)以及毛干前體細胞中均可見有表達，在毛乳頭細胞中可見微弱的表達;而Wnt5a在毛囊的分布范圍較Wnt3a局限，可見只有在毛母質(zhì)，毛干前體細胞和內(nèi)根鞘中有表達，而且表達較微弱。Wnt10b在生長期人毛囊表達部位和Wnt3a相似，但是表達強度是上述三種Wnts中最強的，除了結(jié)締組織鞘以外，在毛囊的各層結(jié)構(gòu)如內(nèi)根鞘、外根鞘、毛母質(zhì)細胞以及毛干前體細胞中均有明顯的表達，而在毛

16、乳頭亦可見微弱的表達。β-catenin和LEF-1是經(jīng)典的Wnt信號通路兩個下游蛋白，它們在生長期的人毛囊中均有表達。其中β-catenin在毛母質(zhì)細胞、毛干前體細胞和內(nèi)根鞘中有明顯的陽性表達，在毛乳頭細胞中有微弱的表達;而LEF-1和β-catenin的表達部位幾乎一致，只是在毛乳頭細胞中的表達較強。
　　 結(jié)論：
　　 Wnt3a、Wnt5a以及Wnt10b在生長期的人毛囊組織中均可見有表達，其中以Wnt10b的表

17、達最強，主要分布在毛囊的內(nèi)根鞘、外根鞘、毛母質(zhì)細胞以及毛干前體細胞中，而在毛乳頭細胞中亦可見微弱的表達，而經(jīng)典的Wnt信號通路了兩個下游蛋白β-catenin和LEF-1在毛母質(zhì)細胞、毛干前體細胞和內(nèi)根鞘，以及毛乳頭細胞中有明顯的陽性表達，說明Wnt10b可能是通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路來維持和調(diào)控處于生長期的人毛囊生長主要的Wnt家族成員。
　　 第二章、體外培養(yǎng)的人毛乳頭細胞特異性標記物表達及細胞增殖能力的

18、分析
　　 目的：探討人毛乳頭細胞經(jīng)過體外長期的傳代培養(yǎng)后，與誘導毛囊生成能力相關(guān)的細胞特異性標記物堿性磷酸酶和胰島素樣生長因子-1的表達情況，以及細胞增殖能力的分析。
　　 方法：
　　 使用膠原酶消化+顯微解剖法將人毛乳頭從毛囊中分離后，在體外進行人毛乳頭細胞的傳代培養(yǎng)，使用real-time QPCR和堿性磷酸酶染色方法檢測第1代～第8代的人毛乳頭細胞在不同傳代時期其特異性標記物ALP和IGF-1的表達結(jié)果

19、，以及通過Cell Counting Kit-8方法檢測不同的傳代時期人毛乳頭細胞增殖能力。
　　 結(jié)果：
　　 人毛乳頭細胞在體外進行長期的傳代培養(yǎng)過程中，不但逐漸喪失其旋渦狀聚集性的生長特性，而且ALP和IGF-1隨著傳代代數(shù)的增加，其表達水平是逐漸降低的。第1代人毛乳頭細胞ALP和IGF-1表達水平分別是第8代細胞表達水平的6.8和3.5倍。第1代和第2代的人毛乳頭細胞ALP染色表達較明顯，但是在第3～6代的人毛乳

20、頭細胞中，ALP陽性的細胞逐漸變少，而且染色逐漸變淺;高傳代細胞如第7、8代細胞的ALP活性表達則非常微弱。不同傳代時期的人毛乳頭細胞增殖能力，亦隨著傳代代數(shù)的增加而逐漸下降，從傳代培養(yǎng)到第7代開始，細胞增殖能力出現(xiàn)一個分水嶺，明顯較第6代以前的細胞增值能力低。
　　 結(jié)論：
　　 人毛乳頭細胞經(jīng)過體外長期的傳代培養(yǎng)后，和誘導毛囊生成能力相關(guān)的特異性標記物的表達水平逐漸下降，從而導致高傳代的人毛乳頭細胞喪失誘導毛囊生長的

21、能力。此外，人毛乳頭細胞亦隨著體外培養(yǎng)傳代代數(shù)的增加，其增殖能力逐漸降低。
　　 第三章、Wnt10b對體外培養(yǎng)的人毛乳頭細胞誘導毛囊生成能力的調(diào)控作用及對人毛乳頭細胞增殖的影響
　　 目的：探討Wnt10b對體外長期培養(yǎng)后的人毛囊毛乳頭細胞誘導毛囊生成能力的調(diào)控作用以及對人毛乳頭細胞增殖能力的影響。
　　 方法：
　　 將人毛乳頭細胞原代分離，在體外傳代培養(yǎng)到第8代后，加入RecombinantHuma

22、n Wnt-10b共培養(yǎng)，通過免疫熒光染色方法檢測人毛乳頭細胞的β-catenin表達，觀察細胞的生長情況，并使用Real-time QPCR檢測與毛乳頭細胞誘導能力相關(guān)的特異性標記物ALP和IGF-1的表達，堿性磷酸酶染色檢測Wnt10b對人毛乳頭細胞的作用，以及通過Cell Counting Kit-8方法檢測Wnt10b對人毛乳頭細胞增殖的影響作用。
　　 結(jié)果：
　　 Wnt10b能夠通過經(jīng)典的Wnt/β-cat

23、enin信號通路作用于在體外長期培養(yǎng)后的人毛乳頭細胞，上調(diào)人毛乳頭細胞特異性標記物ALP和IGF-1的表達，并恢復高傳代人毛乳頭細胞聚集性漩渦狀生長特性，從而維持人毛乳頭細胞的誘導能力。此外，Wnt10b對體外經(jīng)過長期傳代培養(yǎng)后的人毛乳頭細胞增殖具有促進作用。
　　 結(jié)論：
　　 Wnt10b能夠通過上調(diào)特異性標記物ALP和IGF-1的表達以及恢復高傳代人毛乳頭細胞聚集性漩渦狀生長特性來維持體外長期培養(yǎng)后的人毛乳頭細胞的

24、毛囊誘導能力，以及具有促進長期培養(yǎng)后的人毛乳頭細胞增殖能力的作用。
　　 第四章、初步探討Wnt10b對人毛囊毛干生長的影響作用
　　 目的：Wnt10b對生長期人毛囊毛干生長的影響作用及調(diào)控機制的初步探討。
　　 方法：
　　 將人毛囊組織進行顯微解剖分離后，分為空白對照組和實驗組。①空白對照組:人毛囊+DMEM基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)。②實驗組:將Recombinant HumanWnt-10b2μg/ml加入

25、DMEM基礎培養(yǎng)基中，和人毛囊共培養(yǎng)。上述實驗分組每組設6個毛囊樣本，3天換液一次，培養(yǎng)5天后，在雙目體視解剖顯微鏡下測量各實驗組毛干生長長度。
　　 結(jié)果：
　　 將完整的生長期人毛囊進行器官培養(yǎng)，實驗組相比于空白對照組，和Recombinant Human Wnt-10b共培養(yǎng)的人毛囊毛干生長速度明顯增加，毛干長度比對照組長。
　　 結(jié)論：
　　 實驗結(jié)果顯示，在空白對照組中，將人毛囊器官和無血清的培

26、養(yǎng)基培養(yǎng)后，毛干生長速度緩慢;而在實驗組中，由于加入了Recombinant Human Wnt-10b，毛干生長速度明顯較空白對照組快，毛干生長長度更長，證實Wnt10b對人毛干的生長具有明顯的促進作用。
　　 全文小結(jié)：
　　 1.在生長期的人毛囊組織上檢測Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b以及經(jīng)典的Wnt信號通路下游蛋白β-catenin和LEF-1的表達情況，其中Wnt10b的陽性表達最明顯，而β-cateni

27、n和LEF-1與Wnt10b在毛母質(zhì)、毛干前體細胞和內(nèi)根鞘，以及毛乳頭出現(xiàn)表達重疊的現(xiàn)象，說明Wnt10b可能是通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路來維持和調(diào)控處于生長期的人毛囊生長主要的Wnt家族成員。
　　 2.檢測了人毛乳頭細胞經(jīng)過體外長期的傳代培養(yǎng)后，與誘導毛囊生成能力相關(guān)的細胞特異性標記物ALP和IGF-1的表達情況，以及細胞增殖能力的分析。實驗結(jié)果說明經(jīng)過體外長期的傳代培養(yǎng)后，人毛乳頭細胞的ALP和IGF-1

28、表達水平和細胞的增殖能力并不是恒定不變的，而表現(xiàn)為一種逐漸下降的趨勢，為進一步驗證Wnt10b對人毛囊生長的調(diào)控作用提供了理論基礎;
　　 3.觀察了Wnt10b對體外長期培養(yǎng)后的人毛囊毛乳頭細胞誘導毛囊能力的調(diào)控機制，以及細胞增殖能力的影響作用，證實了Wnt10b具有能夠維持人毛乳頭細胞的誘導能力以及促進其增殖的作用;
　　 4.初步探討Wnt10b對人毛囊毛干的作用，證實了Wnt10b能夠促進人毛囊毛干的生長;