Wnt10b在毛囊周期調(diào)控中的作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　 毛囊是具有周期性生長特性的一個特殊器官，毛囊周期分為生長期、退化期和靜止期。在靜止期，毛囊細胞受到某些因素的刺激，會再次進入生長期，如此周而復(fù)始在哺乳動物的整個生命期間循環(huán)往復(fù)。毛囊經(jīng)歷生長期、退化期、靜止期循環(huán)后再次進入生長期的過程稱為毛囊周期性再生。由于毛囊具有周期性生長的特性，為組織再生研究提供了一個非常好的模型。如果毛囊各周期轉(zhuǎn)換中的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，就可能會影響毛囊的生長，進而出現(xiàn)毛囊相關(guān)疾病，例如脫

2、發(fā)、斑禿等。而斑禿等的治療在機制研究和臨床研究上還存在諸多問題，如容易復(fù)發(fā)等。
　　 因此，毛囊周期的調(diào)控就顯得至關(guān)重要，毛囊周期由毛囊干細胞介導(dǎo)發(fā)生。毛囊干細胞的激活和靜息受到多種信號通路的調(diào)控，包括Wnt信號通路、BMP信號通路、FGF信號通路、Shh信號通路等。Wnt信號通路廣受關(guān)注，它分為經(jīng)典Wnt信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路，在毛囊的發(fā)育和周期性再生中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。經(jīng)典Wnt信號通路研究較多，在經(jīng)典Wnt信號

3、通路的各個重要環(huán)節(jié)進行阻斷，均會嚴(yán)重影響毛囊的生成。激活Wnt信號通路的Wnt蛋白有19種，但在毛囊周期性再生中，哪種或哪幾種發(fā)揮關(guān)鍵作用，還不得而知。作者通過文獻篩選，發(fā)現(xiàn)Wnt10b在皮膚附件發(fā)育時具有最明顯的限制性表達，即特異性地表達于毛囊發(fā)育早期的基板。而毛囊的周期性再生過程與毛囊發(fā)育具有相似性，因此，作者推測Wnt10b在毛囊周期調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。
　　 目的與意義：
　　 本課題擬研究Wnt10b在毛囊周

4、期調(diào)控中發(fā)揮的具體作用，并探討其作用機制。為研究基于Wnt蛋白的治療毛囊周期性再生障礙相關(guān)疾病的藥物提供基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 1.Wnt10b在毛囊周期中的表達觀察①用免疫組化的方法觀察Wnt10b蛋白在小鼠生后正常周期毛囊中的表達特性，并采用免疫印跡方法對小鼠各周期中皮膚全層Wnt10b的表達進行半定量分析；
　　 ②制備地高辛標(biāo)記的Wnt10b RNA探針，觀察Wnt10bmRNA在小鼠生后正常周

5、期毛囊中的表達狀況，并采用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法對小鼠各周期中皮膚全層Wnt10b的mRNA表達進行半定量分析。
　　 2.Wnt10b對毛囊的作用研究①利用HEK-293細胞擴增，CsCl 超速離心純化AdWnt10b，驗證腺病毒介導(dǎo)目的基因的生物學(xué)活性；
　　 ②解剖顯微鏡分離觸須毛囊，建立器官培養(yǎng)模型，并通過熒光染色對模型進行評價，然后用AdWnt10b 處理培養(yǎng)毛囊，離體觀察Wnt10b對毛囊的影響；
　　

6、③在小鼠背部皮內(nèi)注射腺病毒，并通過直接觀察熒光、X-gAl染色等方法對動物模型進行評價，然后在不同時相點注射AdWnt10b，在體觀察Wnt10b對毛囊的影響。
　　 3.Wnt10b的信號通路研究①用免疫組化檢測正常毛囊周期中經(jīng)典Wnt信號通路中的關(guān)鍵分子Frizzled、Lef1、TCF3的蛋白表達，并分別通過原位雜交和免疫組化對β-catenin的原位mRNA和蛋白表達進行檢測，與Wnt10b的表達情況進行對比，進一步利用

7、PCR array 技術(shù)，檢測毛囊不同周期Wnt信號分子間的表達差異；
　　 ②在毛囊器官培養(yǎng)模型上，利用腺病毒載體從細胞膜受體水平、細胞漿水平和細胞核轉(zhuǎn)錄水平分別阻斷經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵分子后，觀察其對AdWnt10b 誘導(dǎo)毛干生長作用的影響；
　　 ③靜止期小鼠拔毛誘導(dǎo)毛囊生長，然后利用腺病毒載體從細胞膜受體水平、細胞漿水平和細胞核轉(zhuǎn)錄水平分別阻斷經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵分子，觀察毛囊生長情況；
　　 在

8、以上各在體動物注射模型上，利用腺病毒介導(dǎo)的β-catenin 干擾序列干擾經(jīng)典Wnt信號通路后，觀察其對Wnt10b 誘導(dǎo)毛囊周期性再生作用的影響。
　　 4.Wnt10b在毛囊周期中的作用機制研究①通過BrdU 標(biāo)記檢測Wnt10b 誘導(dǎo)后不同時相點皮膚及毛囊細胞的增殖情況；
　　 ②通過免疫熒光和免疫印跡研究Wnt10b在JB6細胞系中過表達后對細胞分化的影響。
　　 結(jié)果與討論：
　　 1.Wnt1

9、0b表達與毛囊周期具有時空相關(guān)性Wnt10b蛋白和mRNA在靜止期無表達，在退化期的近心端（靠近真皮一端）內(nèi)外根鞘有弱表達，在生長期的毛母質(zhì)強表達，生長期的內(nèi)外根鞘及前體細胞也有表達。說明Wnt10b與毛囊周期密切相關(guān)，可能在毛囊的周期性再生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　 2.Wnt10b能夠誘導(dǎo)毛囊周期性再生本實驗所擴增的腺病毒具有生物學(xué)活性；研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)AdWnt10b 處理的器官培養(yǎng)毛囊，其毛干生長的速度明顯比對照組快，此離體

10、說明Wnt10b對毛囊生長有促進作用；用AdWnt10b 注射小鼠背皮后，能夠在注射部位觀察到綠色熒光，說明該腺病毒能夠用于在體皮內(nèi)注射；注射AdWnt10b后，生長期和退化期的毛囊無變化，而靜止期毛囊提前進入生長期，此在體說明Wnt10b能誘導(dǎo)毛囊周期性再生。
　　 3.Wnt10b 經(jīng)由經(jīng)典Wnt信號通路發(fā)揮誘導(dǎo)毛囊周期性再生作用檢測正常毛囊周期中經(jīng)典Wnt信號通路中關(guān)鍵分子Frizzled、Lef1、TCF3的蛋白表達，并

11、對β-catenin的原位mRNA和蛋白表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)它們與Wnt10b的表達相關(guān)聯(lián)。進一步通過PCR array分析也發(fā)現(xiàn)，生長期的經(jīng)典Wnt信號分子顯著高于靜止期和退化期；在毛囊器官培養(yǎng)模型上，阻斷經(jīng)典Wnt信號通路關(guān)鍵分子后，能夠阻斷AdWnt10b 誘導(dǎo)毛干生長的作用，此離體研究說明Wnt10b 經(jīng)由經(jīng)典Wnt信號通路促進毛干生長；在體動物注射模型上，干擾經(jīng)典Wnt信號通路關(guān)鍵分子β-catenin后，能夠阻斷AdWnt10

12、b 誘導(dǎo)毛囊周期性再生的作用，此在體研究說明Wnt10b 經(jīng)由經(jīng)典Wnt信號通路誘導(dǎo)毛囊的周期性再生。
　　 4.Wnt10b 可能通過誘導(dǎo)表皮基底層細胞增殖、分化而啟動毛囊周期性再生BrdU 標(biāo)記檢測增殖發(fā)現(xiàn)Wnt10b 誘導(dǎo)后24h，表皮基底層細胞最先發(fā)生增殖，然后全層皮膚和毛囊細胞發(fā)生增殖。提示W(wǎng)nt10b 可能通過直接或間接作用于表皮基底層細胞，來發(fā)揮誘導(dǎo)毛囊周期性再生的作用；Wnt10b 誘導(dǎo)表皮基底層細胞表達毛囊結(jié)構(gòu)