南極海洋微生物N2a鑒定、系統(tǒng)學(xué)及一種低溫過氧化氫酶BNC純化與性質(zhì)研究.pdf

1、低溫過氧化氫酶（ECl.11.1.6)是好氧低溫生物代謝必需的抗氧化酶。低溫過氧化氫酶研究對于認(rèn)識海洋微生物在低溫下有氧代謝活動規(guī)律有重要意義。本研究從南極海水中篩選出高活性過氧化氫酶菌株，鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌。詳細(xì)研究了芽孢桿菌目(Bacillales)中產(chǎn)芽孢細(xì)菌尤其是芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S rDNA系統(tǒng)學(xué)，給出了新的分組結(jié)果。首次從海洋革蘭氏陽性菌中分離純化了過氧化氫酶并研究其性質(zhì)，分析了低溫蔭和同源的中溫酶差

2、別不明顯的現(xiàn)象。 從南極表層海水中分離細(xì)菌并篩選高過氧化氫酶活性的菌株，獲得的49株細(xì)菌用硫代硫酸鈉滴定法初篩后，其過氧化氫酶活性都高于大腸桿菌的酶活。用紫外分光光度法復(fù)篩后有15株菌的過氧化氫酶活性高于藤黃微球菌的酶活。其中N2a菌株活性最高，超聲破碎細(xì)胞后活性達(dá)1200 U/mg。49株細(xì)菌的形態(tài)與生理生化特征表明它們屬于同種細(xì)菌。進(jìn)一步測定N2a的脂肪酸含量與16S rDNA序列后將其鑒定為芽孢桿菌屬的細(xì)菌。N2a是專性好

3、氧，能運動，產(chǎn)芽孢的桿菌，主要脂肪酸為iso-Cl14:1，iso-C15:0，anteiso-C15:0和iso-C14:0。N2a與B.barbaricus、B.arsenicus，B.macauensis和B.gelatini的16S rDNA序列相似性分別為99.4％、97.9％、96.1％和95.3％。N2a的表型(4℃生長，7％NaCl生長)和脂肪酸含量(不飽和脂肪酸占40％以上)體現(xiàn)出低溫海洋菌的特征，不同于和N2a的16

4、S rDNA序列相近的菌株。所以N2a可能是Bacillus新種。 好氧產(chǎn)芽孢的細(xì)菌的系統(tǒng)學(xué)長期以來研究較少，特別是Bacillus屬及相近屬的系統(tǒng)學(xué)存在問題。本文根據(jù)16SrDNA序列，用鄰位連接法(NJ)、簡約法(MP)、最小進(jìn)化法(ME)、最大似然法(ML)和貝葉斯推斷(BI)五種算法構(gòu)建了181種芽孢桿菌屬及相關(guān)屬細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹。BI算法得到的進(jìn)化樹最理想，其次是ML。各種系統(tǒng)進(jìn)化樹都表明，Bacillus不是單系群，

5、芽孢桿菌屬及相關(guān)屬細(xì)菌可以劃分為9個組。芽孢桿菌屬模式種B.subtilis屬于組1。N2a菌株屬于組7。組4，組6和組8的細(xì)菌在表型上有一致性，分別為嗜熱菌、嗜鹽菌和嗜堿菌，而其它各組內(nèi)的細(xì)菌在表型上無一致性。組2，組4和組8是由芽孢桿菌屬及相關(guān)屬細(xì)菌組成的，說明目前芽孢菌的分類系統(tǒng)和16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹不完全-致。組9主要由芽孢桿菌科除Bacillus以外的屬組成，其中的4種芽孢桿菌可能屬于其它的屬。還有4種芽孢桿菌位于9個組

6、之外，應(yīng)建立新屬或劃入其它屬。 從Bacillus sp.N2a菌體中分離純化其過氧化氫酶(BNC)，采用50 mmol/L pH7.5 Tris·Cl緩沖液。菌體超聲波破碎并離心后加入硫酸銨粉末，收集40％至70％飽和度之間的沉淀，樣品透析后使用AKTA FPLC進(jìn)行離子交換和分子篩層析。DEAE-Sephadex A-25陰離子交換層析以NaCl梯度洗脫，在0.13 mol/L NaCl時收集活性峰。聚乙二醇20000濃縮樣

7、品后使用Sephacryl S200HR分子篩層析。得到的過氧化氫酶在變性和非變性條件下電泳均為單一條帶，比活80000U/mg。Sephacryl S200HR分子篩測定BNC分子量為230 kD，SDS-PAGE測得亞基分子量為56 kD，表明BNC是同源四聚體。Bio-Rad Rotofor等電聚焦電泳測得BNC的pI=4.2。BNC最適溫度25℃，最適pH6-11，活性受疊氮鈉、鹽酸羥胺和巰基乙醇的抑制。這些性質(zhì)表明BNC屬于小

8、亞基單功能過氧化氫酶。BNC的活化能13 kJ，表明它同其它小亞基單功能過氧化氫酶類似，屬于非溫度依賴性的酶。BNC在4℃和25℃的催化效率分別為3.6×106和4×104M-1s-1。BNC低溫下高催化效率保證代謝產(chǎn)生的過氧化氫被迅速清除。BNC的熱穩(wěn)定性低于來自中溫芽孢桿菌的小亞基過氧化氫酶，可以認(rèn)為BNC屬于低溫酶。BNC來自在自然環(huán)境中自由生活的細(xì)菌，可以作為低溫小亞基單功能過氧化氫酶的代表。BNC和同源中溫酶的活化能、催化效率