美洲大蠊多肽提取物制備工藝及抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的：
　　初步優(yōu)選美洲大蠊多肽提取物的提取方法、多肽含量測(cè)定方法，深入研究美洲大蠊多肽提取物的體內(nèi)抗腫瘤作用及體外對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響，旨在為美洲大蠊用于惡性腫瘤的治療提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)可為從天然藥物中提取低毒高效的抗腫瘤活性部位提供新方向。
　　方法：
　?。?）制備工藝研究：采用超聲法、滲濾法、加熱回流法三種方法提取美洲大蠊多肽，同時(shí)采用福林酚法和雙縮脲法兩種方法測(cè)定美洲大蠊多肽提取物中的多肽含量，比

2、較三種提取方法和兩種測(cè)定方法的結(jié)果從而初步優(yōu)選美洲大蠊多肽提取物的提取方法及多肽測(cè)定方法。
　?。?）體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)：建立小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180的移植性腫瘤模型，檢測(cè)美洲大蠊多肽提取物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。觀察小鼠的活動(dòng)情況及體重變化，評(píng)價(jià)美洲大蠊多肽提取物的體內(nèi)抗腫瘤活性。
　?。?）體外對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響：以A549（人肺腺癌細(xì)胞株）、SGC-7901（人胃癌細(xì)胞株）和Hela（人宮頸癌細(xì)胞株）為實(shí)驗(yàn)對(duì)

3、象，經(jīng)不同濃度的美洲大蠊多肽提取物作用48 h后，采用Cell Counting Kit(CCK-8)WST-8試劑盒測(cè)定對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。美洲大蠊多肽提取物對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響采用Hoechst33258熒光染色及流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　（1）加熱回流法提取的美洲大蠊多肽含量為34.18％和30.05%，超聲法為25.63%和20.19%，滲濾法為28.74%和24.9

4、0%，加熱回流法對(duì)美洲大蠊多肽的提取明顯優(yōu)于超聲法和滲濾法。雙縮脲法測(cè)定美洲大蠊多肽提取物中的多肽含量為25.63%、28.74%、34.18%，福林酚法為20.19%、24.90%、30.05%，通過(guò)兩種方法的比較，雙縮脲法對(duì)多肽測(cè)定存在高效性，明顯優(yōu)于福林酚法。
　?。?）美洲大蠊多肽提取物25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg（以多肽濃度計(jì)算）對(duì)H22實(shí)體瘤生長(zhǎng)的抑瘤率分別為23.77%、35.83%、65.63%

5、；對(duì)S180實(shí)體瘤生長(zhǎng)的抑瘤率分別為20.16%、35.27%、57.36%，明顯抑制S180和H22荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。
　?。?）美洲大蠊多肽提取物能明顯抑制A549細(xì)胞的增殖，隨濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，其IC50為54.65±1.73μg/ml，但對(duì)SCG-7901、Hela細(xì)胞作用不強(qiáng)，因此僅采用A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。美洲大蠊多肽提取物作用于A549細(xì)胞48h后，Hoechst33258熒光染色顯示,不同濃度的美洲大

6、蠊多肽提取物干預(yù)后可見(jiàn)核濃縮致密的強(qiáng)熒光團(tuán)塊及核碎裂等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，而陰性對(duì)照組成彌散均勻的淡藍(lán)色弱熒光。AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)顯示,10、20、40、80、160μg/ml（以多肽濃度計(jì)算）的美洲大蠊多肽提取物均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為20.43±1.53%,34.86±2.01%,44.68±1.84%,53.19±1.53和65.57±2.14%,與陰性對(duì)照組比較，差異有顯著性（