用BAC介導的轉基因鼠研究人α與β珠蛋白基因簇的表達調控.pdf

1、人類珠蛋白基因家族分為α和β兩個基因簇。位于第16號染色體短臂上的α-珠蛋白基因簇以5'-ζ-ψζ-ψα-α2-α1-θ-3'順序排列，其中ζ為胚胎型功能基因，α為胎兒型和成年型功能基因，全長約40kb；位于第11號染色體短臂上的β-珠蛋白基因簇以5'-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3'順序排列，其中ε為胚胎型功能基因，Gγ和Aγ為胎兒型功能基因，β為成年型功能基因，全長約50kb。 珠蛋白基因在個體發(fā)生中表現為依次表達，并具

2、有高度的組織特異性和發(fā)育階段特異性；兩類珠蛋白基因的終產物間始終維持平衡。珠蛋白基因的轉錄受編碼基因與其旁側序列甲基化程度、順式作用元件、細胞內反式作用因子和染色質結構的調節(jié)控制。β-珠蛋白基因座控制區(qū)(LocusControlRegion，LCR)位于ε-基因上游，由四個紅系特異性的DNaseⅠ高敏位點(HS)和一個非紅系特異性的HS(功能有爭議)組成，它們對于β-珠蛋白基因簇內各個珠蛋白基因在紅系組織細胞中的高表達是必需的。α-珠蛋

3、白基因簇上游亦存在類似的一系列高敏位點(PositiveControlElement，PCE)，參與調控α樣珠蛋白基因的表達。 轉基因動物是指以實驗方法導入的外源基因在其染色體基因組中穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。利用轉基因動物研究真核基因的表達調控可以在分子水平上設計實驗，從四維時空觀察轉基因的整體效應。此外，利用轉基因動物技術可以建立人類疾病相關基因的轉基因動物模型，以探討異?；虻谋磉_調控規(guī)律。近年發(fā)展起來的建立在大

4、腸桿菌F因子基礎上的細菌人工染色體(BacterialArtificialChromosome，BAC)載體，可攜帶長達300kb以上的外源DNA片段，使人們得以利用包含完整基因簇的大片段DNA進行轉基因動物研究，克服以往小片段重組體轉基因實驗中忽略基因間或調控元件之間相互作用的缺陷，從而研究大片段基因簇的表達調控規(guī)律。BAC載體的遺傳特性穩(wěn)定，不易發(fā)生缺失和重組；制備和純化方法簡便快速；可直接進行DNA測序分析；載體上的稀有限制性內切

5、酶NotI位點可以方便地線性化BACDNA并去除載體片段，具有粘粒(Cosmid)、酵母人工染色體(YeastAritificialChromosome，YAC)等其他大容量載體不可比擬的優(yōu)越性。因此在人類基因組計劃和基因表達調控等研究領域，BAC文庫獲得了廣泛的應用。 本研究首先利用溫度敏感型穿梭載體(shuttlevector)介導的同源重組的方法，修飾含全長人β珠蛋白基因簇及一段IL-11受體α鏈基因的BAC克隆，經氯霉

6、素(Ch1)正篩選和鐮孢菌酸(FA)負篩選，獲得發(fā)生兩次同源重組后只含修飾后BACDNA而穿梭載體已丟失的菌株。經脈沖場凝膠電泳(PulseFieldGelElectrophoresis，PFGE)鑒定后，大量提取并純化BACDNA后，用NotI酶切分離出包含完整人β-珠蛋白基因簇的插入片段，經SepharoseCL-4B柱凝膠過濾層析快速分開了插入DNA片段和載體DNA，選擇合適濃度的DNA經顯微注射制作轉基因小鼠，并成功地建立了相關

7、的轉基因動物。核酸酶保護實驗(RNaseProtectionAssay，RPA)結果顯示含完整人LCR結構的轉基因小鼠體內的人β類珠蛋白基因表達呈現正確的組織特異性和發(fā)育階段特異性，IL-11α鏈受體基因的有無并沒有影響轉基因鼠體內的人β類珠蛋白基因發(fā)育階段特異性表達。但在HS5缺如的轉基因鼠中，人γ-珠蛋白基因不表達，進一步證實LCR結構的完整性對β-珠蛋白基因簇的表達調控至關重要。 為探討LCR與PCE對兩類珠蛋白基因簇表

8、達調控模式上的差異，采用改良的ETCloning同源重組技術，分別修飾BAC186D7及BAC191K2克隆，構建含LCR與α結構基因的重組體，獲得9株轉基因鼠。收集4株外源基因單拷貝的轉基因鼠胚胎組織，檢測α-類珠蛋白基因的表達情況。結果表明：1)人ζ-珠蛋白基因的轉錄在胚胎期正常開啟(表達量8.5天與9.5天最多，以后逐漸減少)，成年期關閉。2)人α2珠蛋白基因在轉基因小鼠的整個胚胎發(fā)育中持續(xù)表達，但成年期表達水平明顯高于胚胎期，這

9、與鼠內源α基因表達模式相似。3)人α1珠蛋白基因僅在12.5天胎肝中才出現表達，且表達量較之α2珠蛋白低。4)4個株系轉基因鼠的人α珠蛋白基因表達水平存在差異，其中有一株不表達，其余3株分別為鼠內源珠蛋白表達水平的30％-140％，說明外源基因位于染色體的不同整合位點環(huán)境對其表達水平有影響，缺乏整合位點不依賴性。 綜上結果說明：1)利用溫度敏感型的穿梭載體經同源重組，成功刪除了位于嵌合體B5-BAC克隆中IL-11受體α鏈基因

10、，建立了相關的轉基因鼠模型。2)IL-11受體α鏈基因的有無并不影響β珠蛋白基因的發(fā)育模式及表達水平。但LCR中HS5的缺如，使γ珠蛋白基因在胚胎發(fā)育中不表達。3)利用改良的ETCloning同源重組技術，構建了含LCR與反向α結構基因的重組體，獲得9株轉基因鼠。4)上游調控序列LCR取代PCE后，并沒有影響距離LCR最遠的人ζ-珠蛋白基因表達的發(fā)育模式，但較正常α轉基因鼠的關閉時相提前。說明人ζ-珠蛋白基因對上游調控序列的依賴性較小，

11、而受鄰近序列的影響較大，如啟動子序列，3'-非翻譯區(qū)序列等，更傾向于自我調控。人α珠蛋白基因的開關受到影響，表現在人α2珠蛋白基因在轉基因小鼠的整個胚胎發(fā)育中持續(xù)表達，但成年期表達水平明顯高于胚胎期，與鼠內源α基因表達模式相同，然而人α1珠蛋白基因僅在成年期表達，且表達量較之α2珠蛋白低。此外，4個株系轉基因鼠的人α-類珠蛋白基因表達水平存在差異，其中有一株不表達，說明外源基因位于染色體的不同整合位點環(huán)境對其表達水平有影響，缺乏整合位點