提高人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子在植物中表達的策略研究.pdf

1、外源基因在宿主體內的表達水平是決定生物反應器能否產業(yè)化的關鍵。制約植物生物反應器應用的主要問題是，外源蛋白在植物體內的累積水平低，生產成本高，產品沒有市場競爭能力。若要實現工業(yè)生產，理論上外源蛋白的表達量應達到植物總可溶性蛋白的1％以上。目前，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)在很多宿主細胞中都得到表達，但用植物生產人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子時，表達水平很低，遠未達到工業(yè)生產要求。 人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子是一

2、種能夠刺激粒細胞和巨噬細胞增殖、成熟和分化的糖蛋白。它是一種造血生長因子，能提高機體的免疫能力，主要用于治療在骨髓移植、癌癥化療等過程中引起的白細胞減少病癥。hGM-CSF基因全長2.5 kb，含有4個外顯子和3個內含子。人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子由144個氨基酸組成，其中前17個氨基酸為信號肽，成熟hGM-CSF由127個氨基酸組成，相對分子量約為16，293。 本研究選用在種子中特異表達的β-伴大豆球蛋白α'亞單位啟動子，

3、在啟動子下游插入煙草花葉病毒的5'非轉錄區(qū)(Ω序列)。對翻譯起始位點序列進行改造，使之符合植物Kozak序列的特征。 本研究對hGM-CSF基因進行人工改造，包括：①對hGM-CSF基因的信號肽進行人工改造。用菜豆植物血球凝集素(PHA-E)的信號肽替換hGM-CSF的信號肽，PHA-E信號肽具有偏向植物氨基酸密碼子的特點，有助于提高基因的翻譯水平。②對hGM-CSF基因的末端進行人工改造。hGM-CSF末端分別連接了內質網駐留

4、信號(KDEL)和貯藏囊泡靶向信號。KDEL四肽能夠將目標蛋白導向內質網，避免蛋白受到蛋白酶的破壞，從而提高目標蛋白的積累水平。在hGM-CSF基因的末端加上菜豆7S球蛋白(phaseolin)貯藏囊泡靶向信號(AFVY)，AFVY短肽能夠將重組蛋白導向蛋白貯藏囊泡，提高種子中蛋白的積累。③對hGM-CSF基因的3'-非翻譯區(qū)進行人工改造。在hGM-CSF基因的3'-非翻譯區(qū)插入人的7SL RNA Ⅳ區(qū)的44個核苷酸，7SL RNA Ⅳ

5、區(qū)能夠形成具有三個環(huán)的二級結構，與信號識別顆粒(SRP)中的蛋白亞基SRP54結合，是一種“天然”的適配體(aptamer)。將改造后的啟動子和 hGM-CSF 基因構建成表達載體pCAMBIA2300-CSF1 、pCAMBIA2300-CSF-KDEL 、pCAMBIA2300-CSF-AFVY、pCAMBIA2300-CSF-AP，轉化擬南芥。 本研究還探討了利用反義干擾技術來提高外源基因的表達可行性。利用擬南芥at2S2

6、基因本身的啟動子和poly(A)信號，構建含反義at2S2基因的表達載體pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S 和pCAMBIA2300-CSF-AFVY-anti2S，轉化擬南芥。 將構建的pCAMBIA2300-CSF1、pCAMBIA2300-CSF-KDEL、pCAMBIA2300-CSF-AFVY 、pCAMBIA2300-CSF-AP 、pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S和pCAM

7、BIA2300-CSF-AFVY-anti2S表達載體轉化擬南芥，在含卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選。分別篩選出C(轉化pCAMBIA2300-CSF1)、KD(轉化pCAMBIA2300-CSF-KDEL)、AF(轉化pCAMBIA2300-CSF-AFVY)、AP(轉化pCAMBIA2300-CSF-AP)、KDS(轉化pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S)、AFS(轉化pCAMBIA2300-CSF-AFVY-anti2

8、S)轉基因株系50、32、28、6、7、9個。AP、KDS和AFS系列轉基因植株出現部分植株種子敗育的現象，但仍有一部分植株得到后代并且能夠穩(wěn)定遺傳下去。 采用PCR擴增初步驗證轉基因植株。Southern雜交表明，AP、KDS、AFS系列的轉基因植株，雖然存在拷貝數的差異，但外源基因已經整合到基因組中。對于AF和KD系列的轉基因單株，計算T2代分離比例，初步篩選出單拷貝的轉化株，再根據Southern雜交的結果，篩選出單拷貝轉

9、基因植株。對單拷貝的轉化株，用KD6轉化株作為花粉供體，分別與其他單拷貝的KD、AF轉化株進行雜交。 取KD6轉化株根、莖、葉和授粉6天的種子，提取RNA，經DNAaseⅠ處理后，用hGM-CSF基因特異引物進行RT-PCR。結果顯示，β-伴大豆球蛋白α'亞單位啟動子在根、莖、葉中都沒有明顯的表達，在種子中特異表達。取KD6轉化株不同發(fā)育時期的種子，半定量RT-PCR表明，β-伴大豆球蛋白α'亞單位啟動子在種子發(fā)育早期就開始表達

10、，以后逐漸增強，到種子發(fā)育后期仍有很強的表達。 ELISA分析結果顯示，C系列轉基因植株未成熟莢中重組hGM-CSF蛋白含量低于0.01％，在hGM-CSF基因3'-末端加上導向信號后重組蛋白含量顯著提高。KD與AF系列轉基因植株的rhGM-CSF表達水平沒有顯著的差異。表明AFVY和KDEL信號都能夠顯著提高重組蛋白在種子中的積累。KD×KD6和AF×KD6雜交當代種子EIASA結果表明，KD×KD6與AF×KD6雜交株當代種子中顯示

11、出基因加性效應，但AF×KD6雜交株基因加性效應比KD×KD6明顯。取重組蛋白積累水平相近的KD1、AF18母本，分別與KD6雜交后，對雜交當代種子中hGM-CSFmRNA定量分析表明，hGM-CSF mRNA表達水平無顯著差異，但重組蛋白的積累水平差異顯著，表明AFVY和KDEL信號在重組蛋白篩選和運輸途徑中獨立起作用。 AP系列轉化株的蛋白積累平均值比KD要高1倍以上，方差分析表明兩組平均值之間存在極顯著差異。對KD和AP系

12、列的轉基因植株進行hGM-CSF mRNA定量結果顯示，mRNA水平越高，重組蛋白積累水平就越高，表明hGM-CSF基因3'-非翻譯端插入7SL RNA Ⅳ區(qū)核苷酸對mRNA的穩(wěn)定起作用。 對KDS、AFS系列轉基因植株at2S2基因mRNA定量分析顯示，反義干擾顯著抑制at2S2基因的表達。SDS-PAGE蛋白電泳結果顯示，擬南芥種子中2S、12S-A和12S-B各個組分之間相對量無明顯變化。抑制at2S2基因表達并沒有改變種

13、子中主要沉降蛋白組分比。反義干擾的轉基因植株重組蛋白表達水平與KD、AF之間有極顯著的差異，表明抑制at2S2基因表達能夠提高重組hGM-CSF蛋白的積累，但hGM-CSF和atS2基因的mRNA定量分析表明，at2S2基因抑制程度與hGM-CSF基因表達水平之間并不存在線性關系。 Western雜交結果顯示，KD、AF和AP表達的重組hGM-CSF蛋白分子量大約在21 kDa左右，與轉基因煙草相似，比天然hGM-CSF分子量要