L型PML-RARα融合基因E5（-）E6（-）剪接體對三氧化二砷作用敏感性研究.pdf

1、目的：急性早幼粒白血病細(xì)胞L型PML-RARα融合基因，由于PML基因第5、6外顯子存在選擇性剪接，形成E5(-)E6(+)(第5外顯子缺失)，E5(-)E6(-)(第5、6外顯子均缺失)，E5(+)E6(+)(第5、6外顯子均存在)三種不同的剪接轉(zhuǎn)錄本。前期研究已證實(shí)：高表達(dá)E5(-)E6(-)剪接體的急性早幼粒白血病患者預(yù)后差，可能由于其失去核定位信號(hào)導(dǎo)致胞漿定位而表現(xiàn)出對ATRA誘導(dǎo)分化作用敏感性差。本研究旨在穩(wěn)定表達(dá)剪接體的克隆

2、細(xì)胞與NB4細(xì)胞水平探討E5(-)E6(-)剪接體對三氧化二砷（ATO，As2O3）作用的敏感性，從而為急性早幼粒細(xì)胞白血病患者提供臨床治療指導(dǎo)。
　　方法：⑴將NB4細(xì)胞經(jīng)0.1μM、0.2μM、1.0μM、1.5μM和2.0μM ATO分別作用0-96h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物作用后各時(shí)間點(diǎn)NB4細(xì)胞CD33和CD11b的表達(dá)、Annexin-V和PI（Propidium Iodide）的陽性率，分析其分化和凋亡情況，確定AT

3、O作用濃度。⑵采用熒光定量PCR法檢測分化和凋亡最佳濃度的ATO作用于NB4細(xì)胞后，各時(shí)間點(diǎn)E6(+)和E5(-)E6(-)剪接體表達(dá)量變化。⑶將前期構(gòu)建成功的pCDH1空載體、pCDH1-E5(-)E6(+)、pCDH1-E5(-)E6(-)分別與包裝輔助質(zhì)粒pVSV-G、 pPACKH1-REV和pPACKH1-GAG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集病毒顆粒，感染HL-60細(xì)胞，用有限稀釋法篩選不同剪接體穩(wěn)定克隆細(xì)胞株。⑷將穩(wěn)定克隆細(xì)胞分別

4、經(jīng)0.2μM、1.5μM ATO作用0-96h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物作用后各時(shí)間點(diǎn)穩(wěn)定克隆細(xì)胞CD33和CD11b的表達(dá)、Annexin-V和PI的陽性率；同時(shí)，采用熒光定量PCR法分別檢測分化和凋亡過程中，各時(shí)間點(diǎn)穩(wěn)定克隆細(xì)胞剪接體表達(dá)量變化；采用免疫熒光法聯(lián)合共聚焦熒光顯微鏡觀察各時(shí)間點(diǎn)穩(wěn)定克隆細(xì)胞PML核體的變化。
　　結(jié)果：①不同ATO藥物濃度作用于NB4細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長，0.2μM ATO組NB4細(xì)胞 CD1

5、1b的表達(dá)較其余組別呈明顯上升趨勢，而1.5μM ATO組NB4細(xì)胞的Annexin-V和PI表達(dá)上升趨勢明顯，故確定ATO分化與凋亡最佳濃度分別為0.2μM和1.5μM。②熒光定量PCR檢測結(jié)果表明：1.5μM ATO作用于NB4細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長E6(+)和E5(-)E6(-)剪接體的表達(dá)量均呈逐漸下降趨勢，且在72h和96h與對照組相比有顯著的差異（P<0.05）；0.2μM ATO作用于NB4細(xì)胞，隨著藥物作用時(shí)間的延長E6

6、(+)、E5(-)E6(-)剪接體表達(dá)量下降趨勢不明顯，且各時(shí)間點(diǎn)與對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；同一濃度、同一時(shí)間點(diǎn)E6(+)、E5(-)E6(-)剪接體表達(dá)量下降程度均無顯著性差異（P>0.05）。③穩(wěn)定表達(dá)剪接體的克隆細(xì)胞篩選：通過慢病毒感染HL-60細(xì)胞，有限稀釋法篩選穩(wěn)定克隆細(xì)胞株，最終得到HL-60-pCDH1空載體、HL-60-pCDH1-E5(-)E6(+)、HL-60-pCDH1-E5(-)E6(-)三種分別

7、表達(dá)各剪接體的穩(wěn)定克隆細(xì)胞，并經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證，目的基因均有正確表達(dá)。④0.2μM、1.5μM ATO作用于穩(wěn)定表達(dá)剪接體的克隆細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長，0.2μM ATO組pCDH1空載體、pCDH1-E5(-)E6(+)、pCDH1-E5(-)E6(-)穩(wěn)定克隆細(xì)胞CD11b的陽性率隨著藥物作用時(shí)間的延長呈上升趨勢，pCDH1空載體組上升趨勢更明顯；1.5μM ATO組三種剪接體穩(wěn)定克隆細(xì)胞Annexin-V和PI的陽性率隨著藥

8、物作用時(shí)間的延長而遞增，pCDH1空載體組上升趨勢更明顯。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明：1.5μM ATO組隨著藥物作用時(shí)間的延長pCDH1-E5(-)E6(+)、pCDH1-E5(-)E6(-)穩(wěn)定克隆細(xì)胞其E6(+)、E5(-)E6(-)剪接體的表達(dá)量分別呈逐漸下降趨勢；0.2μM ATO組隨著藥物作用時(shí)間的延長E6(+)、E5(-)E6(-)剪接體表達(dá)量下降趨勢不明顯。同一濃度、同一時(shí)間點(diǎn)E6(+)、E5(-)E6(-)剪接體表達(dá)量

9、下降程度均無顯著性差異。⑤免疫熒光聯(lián)合共聚焦結(jié)果表明：1.5μM ATO組隨著藥物作用時(shí)間的延長pCDH1-E5(-)E6(+)、pCDH1-E5(-)E6(-)穩(wěn)定克隆細(xì)胞PML核體結(jié)構(gòu)恢復(fù)成正常的數(shù)十個(gè)斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)；0.2μM ATO組隨著藥物作用時(shí)間的延長 pCDH1-E5(-)E6(+)、pCDH1-E5(-)E6(-)穩(wěn)定克隆細(xì)胞PML核體結(jié)構(gòu)變化不明顯。
　　結(jié)論：從內(nèi)源性和外源性兩方面均證實(shí)E5(-)E6(-)剪接體對