人工轉(zhuǎn)錄因子的設(shè)計以抑制乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄.pdf

1、目的：
　　設(shè)計特異性結(jié)合乙肝病毒核心啟動子的人工轉(zhuǎn)錄因子并觀察其對乙肝病毒轉(zhuǎn)錄的抑制作用。
　　方法：
　　1、利用Zine finger tools設(shè)計特異性靶向HBV核心啟動子的鋅指蛋白，獲得鋅指蛋白的靶序列及氨基酸序列，并對該蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。
　　2、將ZFP氨基酸序列逆向翻譯成核苷酸序列并進(jìn)行優(yōu)化后人工合成。用帶有核定位信號(NLS)的引物擴(kuò)增ZFP片段并將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDN

2、A3.1(+)，構(gòu)建pcDNA3.1(+)-ZFP，然后以此為基礎(chǔ)插入帶有Flag tag的KRAB序列，構(gòu)建人工轉(zhuǎn)錄因子的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ATF。
　　3、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDN.A3.1(+)-ATF到COS-7細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR和Western Blot分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測ATF在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　4、用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ATF或pcDNA3.1

3、(+)分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，ELISA和FQ-PCR檢測上清液中HBeAg和HBVDNA含量，RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)HBV mRNA表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。
　　結(jié)果：
　　1、鋅指蛋白在HBV核心啟動子上的靶序列為：
　　5’-AATGTCAACGACCGACCT-3’
　　2、鋅指蛋白的氨基酸序列為：
　　LEPGEKPYKCPECGKSFSTKNSLTEHQRTHTGEKPYKCPECGK

4、SFSQSGHLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDSGNLRVHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGALVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTTGNLTVHQRTHTGKKTS
　　3、ZFP結(jié)構(gòu)特征分析為：等電點9.20，分子量19.69，穩(wěn)定指數(shù)為31.41，顯示為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測提示該蛋白含有6段C2H2型鋅指單元序列，分別位于其

5、氨基酸殘基序列的第8～30、36～58、64～86、92-114、120-142及148～170位。同源建模也提示其含有6個連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)。Structure Assessment對建模結(jié)果進(jìn)行評估，結(jié)果顯示空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
　　4、pcDNA3.1(+)-ATF轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，經(jīng)RT-PCR及Western Blot檢測，ATF mRNA和融合有Flag tag的ATF蛋白表達(dá)明顯增加，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的細(xì)胞內(nèi)則

6、沒有相應(yīng)的表達(dá)，說明ATF在真核細(xì)胞內(nèi)是能夠正常表達(dá)的。
　　5、ATF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中的HBVDNA和HBeAg含量明顯減少，細(xì)胞內(nèi)的HBV mRNA及HBcAg也顯著降低，說明ATF能夠有效抑制HBV的轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論：
　　利用生物信息學(xué)方法設(shè)計了能特異性結(jié)合HBV核心啟動子的鋅指蛋白，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了完整的人工轉(zhuǎn)錄因子。實驗證明設(shè)計的人工轉(zhuǎn)錄因子能夠在真核細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，