關(guān)節(jié)腔注射黃原膠動物體內(nèi)藥代動力學(xué)研究.pdf

1、黃原膠(xanthan gum，XG)是由野油菜黃單胞桿菌（Xanthomonascampestris）以糖類為主要原料經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)的一種水溶性多糖，相對分子質(zhì)量(relative molecular mass，Mr)為2×106～2×107。XG溶液具有較好的黏彈性，關(guān)節(jié)腔注射可起到潤滑和緩沖應(yīng)力的作用。本實驗室前期研究表明，XG對于實驗性骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)具有較好的治療效果。關(guān)節(jié)腔注射XG可保護關(guān)節(jié)軟骨，減

2、輕OA癥狀，延緩實驗性O(shè)A進程。臨床常用透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)注射液治療OA，但HA容易被體內(nèi)的酶和自由基降解，作用時間較短，短期內(nèi)需頻繁注射。XG與HA同屬生物大分子多糖，具有相似的黏彈性，但XG性質(zhì)穩(wěn)定，不易被體內(nèi)的酶和自由基降解，5周給藥2次XG用于實驗性O(shè)A的療效與5周給藥5次HA的療效并無顯著性差異。關(guān)節(jié)腔注射XG在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的存留時間可能更長，從而能減少注射次數(shù)，減少關(guān)節(jié)腔注射引起的損傷，增加患者的順

3、應(yīng)性。為評價XG的療效及安全性，應(yīng)進行XG注射液體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。本研究通過發(fā)酵法制備14C放射性標(biāo)記XG，研究XG在動物關(guān)節(jié)腔局部的消除規(guī)律，初步闡明XG在體內(nèi)的吸收、分布及排泄特征，為XG注射液的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)，也為XG在其他領(lǐng)域的研究應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。
　　1、發(fā)酵制備14C標(biāo)記黃原膠
　　目的:14C放射性標(biāo)記XG，制備放化純度及比活度可用于動物體內(nèi)藥動學(xué)實驗的14C標(biāo)記XG(14C-XG)樣品。方法:在發(fā)

4、酵培養(yǎng)基中利用14C標(biāo)記葡萄糖（14C-葡萄糖）與普通葡萄糖作混合碳源，經(jīng)發(fā)酵用14C放射性標(biāo)記XG。通過控制總碳源加入量控制產(chǎn)膠量，使培養(yǎng)基中添加14C-葡萄糖的放射性強度一定時，所得被標(biāo)記的XG樣品具備一定的比活度?？疾炝?4C-葡萄糖加入量對產(chǎn)膠量及其利用率的影響。在15 mL發(fā)酵液中加入1200μCi的14C-葡萄糖，發(fā)酵并對所得樣品進行精制純化，制備了14C-XG。結(jié)果:數(shù)據(jù)顯示在碳源濃度0.5％～2％范圍內(nèi)，產(chǎn)膠量與總碳源葡

5、萄糖加入量成線性關(guān)系，加入的14C-葡萄糖在XG粗品的比率約為60％，其加入量對產(chǎn)膠量并無顯著影響。最終采用碳源葡萄糖的總量為0.7％，其中14C-葡萄糖的加入量占總碳源0.71％，發(fā)酵制備了HC-XG。對發(fā)酵所得14C-XG進行純化精制，制得了比活度為7.27μCi/mg，放化純度為99.5％的14C-XG精品，用于動物體內(nèi)藥動學(xué)實驗研究。結(jié)論:采用14C-葡萄糖與普通葡萄糖作混合碳源，可成功發(fā)酵制備14C-XG，工藝穩(wěn)定，可重復(fù)性強

6、。純化所得14C-XG樣品，其放化純度及比活度可用于后續(xù)動物體內(nèi)藥動學(xué)實驗。
　　2黃原膠在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的消除
　　目的:考察關(guān)節(jié)腔注射XG在動物關(guān)節(jié)腔內(nèi)的消除規(guī)律。方法:家兔關(guān)節(jié)腔分別單次注射1％(w/v)的5-氨基硫脲熒光素標(biāo)記XG與14C-XG，劑量為0.1mL/kg，比較研究了熒光標(biāo)記與放射性標(biāo)記XG從家兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)的消除規(guī)律。大鼠單次關(guān)節(jié)腔注射14C-XG（0.25、0.5、1 mg，即濃度0.5％、1％、2％的14C-

7、XG各50μL）后，于不同時間點處死動物，測定關(guān)節(jié)腔內(nèi)放射性殘留，研究XG在大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)消除的動力學(xué)特征。采用14C-XG研究XG在家兔關(guān)節(jié)局部組織的分布。結(jié)果:熒光標(biāo)記與放射性標(biāo)記XG均可從關(guān)節(jié)腔內(nèi)消除。同一時間點，熒光標(biāo)記法測得關(guān)節(jié)腔內(nèi)XG殘留量小于放射性標(biāo)記法測定值。各時間點所獲得14C-XG在關(guān)節(jié)滑液的殘留量，均高于文獻報道同法操作所測得14C標(biāo)記HA在家兔關(guān)節(jié)滑液內(nèi)的殘留量。關(guān)節(jié)腔注射XG1 mg，在大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)的平均滯留時間

8、（mean residence time，MRT）約為333 h，給藥后30d仍有約27％的殘留量，180 d后仍有9.85％的殘留。AUC與給藥劑量成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9999，且同一時間點、不同給藥劑量XG在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的殘留比例差異并不明顯，說明XG在關(guān)節(jié)腔內(nèi)隨時間消除的比例并無明顯劑量依賴性。結(jié)論:XG可在動物關(guān)節(jié)腔內(nèi)消除。XG在關(guān)節(jié)腔內(nèi)消除較慢，MRT超過HA，可延長給藥時間繼續(xù)研究其藥效。家兔關(guān)節(jié)腔注射14C-XG后，主要分

9、布在關(guān)節(jié)滑液，少量可進入關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、半月板、關(guān)節(jié)內(nèi)脂肪及肌肉組織或結(jié)合在其表面。
　　3黃原膠在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)
　　目的:考察了關(guān)節(jié)腔注射XG在大鼠體內(nèi)的吸收、組織分布和排泄規(guī)律。方法:大鼠單次關(guān)節(jié)腔注射14C-XG后(0.25、0.5、1 mg，即0.5％、1％、2％各50μL)，測定不同時間點血漿內(nèi)的藥物濃度。對低、中、高劑量的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)采用非房室模型法計算藥動學(xué)參數(shù)，將AUC和Cmax與給藥劑量進行相關(guān)性

10、分析。設(shè)置腹腔注射對照組進行對比研究。對單次關(guān)節(jié)腔注射14C-XG1 mg的實驗動物，進行不同時間點主要組織藥物殘留測定。收集糞、尿及呼吸排出的CO2，測定排泄物中放射性。結(jié)果:大鼠關(guān)節(jié)腔注射14C-XG后，可在血漿、主要組織器官及排泄物中檢測到放射性。AUC及Cmax與給藥劑量成正相關(guān)，而消除半衰期t1/2、 MRT、達峰時間Tmax與劑量并無顯著依賴性，提示關(guān)節(jié)腔注射XG后在大鼠血漿中的吸收消除情況呈線性動力學(xué)。與腹腔注射相比，關(guān)節(jié)

11、腔注射XG達峰時間遲緩，較腹腔注射吸收慢，關(guān)節(jié)腔注射XG的相對生物利用度為41.7％，較腹腔注射吸收量少。關(guān)節(jié)腔注射14C-XG后，在大鼠各主要組織中均有分布，主要集中在心、肝、脾、肺、腎等血流灌注高的組織，尤其在肝、脾組織中濃度較高，肝臟中藥物總量占給藥劑量的比例最大，給藥后15d可占給藥量16.5％。XG在各組織中均可被清除。關(guān)節(jié)腔注射XG后，在糞便中僅有極微量的藥物排出，少量通過尿排出，大部分通過呼吸排出。給藥后30d，尿中XG累

12、積排泄量為給藥劑量的4.63％，以每天約0.07％給藥劑量的速率緩慢經(jīng)尿排泄。至給藥后90 d，呼吸中XG累積排泄量為21.4％，以每天約0.32％給藥劑量的速率經(jīng)呼吸排泄。結(jié)論:關(guān)節(jié)腔注射XG可吸收進入血液循環(huán)，并分布至主要組織器官，進行代謝排出體外，但關(guān)節(jié)腔注射XG在體內(nèi)消除較慢。
　　4黃原膠代謝初步研究
　　目的:初步考察XG體內(nèi)代謝規(guī)律。方法:測定關(guān)節(jié)腔注射XG后，血漿、組織及尿液中的XG的Mr范圍，探討XG吸收入

13、血的形式。體外分別用自由基及大鼠肝臟溶酶體與XG共孵育，采用流變儀測定XG黏彈性和多角度激光散射法測定XG Mr的變化，探討自由基及肝臟溶酶體對XG的降解作用。結(jié)果:XG以大分子形式吸收進入血液循環(huán)(Mr＞1×105)，在肝臟組織中主要以大分子形式(Mr＞1×105)存在，可代謝為Mr＜1×104的分子從尿液排出。自由基可降低XG的黏彈性。經(jīng)肝臟溶酶體處理的XG，黏度顯著降低，重均相對分子質(zhì)量（weightaverage molecul