棘胸蛙蝌蚪與幼蛙肌肉蛋白質(zhì)組初步研究.pdf

1、棘胸蛙是一種主要分布在我國南方各省山區(qū)的大型經(jīng)濟(jì)蛙類。具有極高的食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究意義重大。 [目的]采用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，通過雙向電泳分離、比較棘胸蛙蝌蚪與幼蛙肌肉組織的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，通過質(zhì)譜檢測分析的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。尋找與鑒定棘胸蛙蝌蚪變態(tài)發(fā)育為幼蛙時(shí)期的肌肉組織存在的蛋白質(zhì)差異表達(dá)，這些存在的差異蛋白質(zhì)可能與棘胸蛙變態(tài)發(fā)育有著密切的關(guān)系，在動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)具有較高的學(xué)術(shù)價(jià)值。 [方法]

2、本研究是建立在蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)技術(shù)和優(yōu)化各類實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用2-DE聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)的技術(shù)路線進(jìn)行了棘胸蛙蝌蚪與幼蛙肌肉組織的蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究。一步法和標(biāo)本混合法提取棘胸蛙蝌蚪與幼蛙肌肉組織的總蛋白質(zhì)；以Bradford測定法繪制蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，對肌肉組織樣品蛋白提取物定量；肌肉組織蛋白質(zhì)提取物以相同加樣量進(jìn)行雙向凝膠電泳；一向等電聚焦，使用固相pH梯度凝膠條(IPGstritpH3-10NL)，膠內(nèi)重泡脹

3、技術(shù)，聚焦總電壓時(shí)80kVh-85kVh；用DTT(二硫蘇糖醇)和碘乙酰胺兩步平衡；二向電泳采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(13％、1.5mm均一膠)；根據(jù)上樣量不同分別進(jìn)行銀染和考馬斯亮藍(lán)染色；用ImageScanner光密度掃描儀(AmershamPharmacia公司產(chǎn)品)獲取染色后的2-DE凝膠圖譜；將2-DE凝膠圖譜輸入計(jì)算機(jī)，通過PDQuest軟件分析找到合適的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；ABI4700TOF-TOF質(zhì)譜儀鑒定與分析所

4、找出的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，得到差異蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋(PMF)和肽序列標(biāo)簽(PST)；用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，對得到的PMF和PST與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白同源查詢，獲取差異蛋白質(zhì)的信息。結(jié)合雙向凝膠電泳相應(yīng)表觀等電點(diǎn)、分子量、匹配肽段和覆蓋率等進(jìn)行綜合分析。 [結(jié)果]通過一步法和標(biāo)本混合法提取棘胸蛙蝌蚪和幼蛙肌肉組織的蛋白定量結(jié)果分別是11.4084μg/μl、10.9956μg/μl。PD

5、Quest軟件分析雙向電泳圖譜結(jié)果，兩個(gè)圖譜對比共有差異點(diǎn)42±5個(gè)。對其中10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過對NCBInr數(shù)據(jù)庫檢索，再通過表觀等電點(diǎn)、分子量、匹配肽段和覆蓋率等分析得到6個(gè)不同的蛋白信息：P1為troponinT3，P2、P3、P6、P7、為fasttroponinT，P4為Aldh-Aprotein，P5為creatinekinase(EC2.7.3.2)-Africanclawedfrog(fragment),P8

6、為Enigma-provprotein,P9、P10為Ckm-provprotein。 [結(jié)論](1)建立了良好的棘胸蛙肌肉蛋白提取法，提高了分離效果，對蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的鑒別可提供更多的信息。(2)應(yīng)用固定pH梯度(IPG)膠條可提高雙向電泳的分辨率和重復(fù)性。(3)對比棘胸蛙蝌蚪與幼蛙肌肉組織的蛋白質(zhì)的雙向電泳圖象分析結(jié)果，表明在棘胸蛙蝌蚪的發(fā)育到幼蛙過程中肌肉有顯著的蛋白表達(dá)差異。(4)通過生物質(zhì)譜鑒定的6種表達(dá)差異蛋白可能與棘胸