適冷海洋青霉纖維素酶和半纖維素酶的分子生物學(xué)研究.pdf

1、與海洋動(dòng)物、植物一樣，海洋微生物也是一類重要的可再生的海洋自然資源，是豐富的基因庫(kù)。尤其經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期環(huán)境適應(yīng)，海洋微生物作為產(chǎn)酶資源具有突出的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：具有顯著的耐壓、耐堿、耐鹽、耐冷和多物種等特性；代謝易于調(diào)控，在低溫條件下具有相對(duì)較高的活性。這些性質(zhì)使得低溫酶在工業(yè)應(yīng)用和基礎(chǔ)研究諸多方面引起濃厚興趣，從而賦予海洋微生物酶獨(dú)特的應(yīng)用前景。 本文從黃海和東海的海底泥樣中分離到51株海洋真菌，對(duì)其中6株產(chǎn)纖維素酶量較高的菌株進(jìn)行

2、了較為詳細(xì)的研究。這6株海洋真菌的最適生長(zhǎng)溫度均在15-25℃，最高生長(zhǎng)溫度均不超過(guò)37℃。其中一株編號(hào)為FSOlO的菌株的纖維素酶活性最高，對(duì)其生長(zhǎng)的適冷性和它產(chǎn)生的纖維素酶的冷活性進(jìn)行了研究。另對(duì)其培養(yǎng)條件及影響產(chǎn)酶的因素也進(jìn)行了分析，得到最優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基。 FSOlO菌株的最適生長(zhǎng)溫度為15℃，最高生長(zhǎng)溫度不超過(guò)37℃，在O℃也能夠正常生長(zhǎng)和產(chǎn)生孢子，屬于典型的適冷菌。其最適產(chǎn)酶溫度為15℃，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3

3、d，纖維素酶活力達(dá)到23.6U/ml。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)FSOlO菌株的營(yíng)養(yǎng)菌絲呈白色，有隔膜，產(chǎn)生青霉特有的帚狀分生孢子頭，未發(fā)現(xiàn)有性孢子，未見孢子囊和子囊殼等特化的細(xì)胞和組織體。形態(tài)學(xué)特征初步鑒定該海洋真菌為青霉。為進(jìn)一步鑒定FS010菌株，我們通過(guò)通用引物PCR克隆了該菌株的1 8S rDNA基因，擴(kuò)增長(zhǎng)度為1797bp，測(cè)序結(jié)果分析表明和產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)KCTC6052的1 8S rDNA

4、相似性最高，達(dá)99.2％。另克隆了該菌株線粒體小亞基rDNA基因，測(cè)序結(jié)果分析和1 8S rDNA基因的分析結(jié)果一致，因此我們判斷適冷海洋青霉FS010屬于產(chǎn)黃青霉。 采用生物信息學(xué)手段分析了8種絲狀真菌外切葡聚糖纖維二糖水解酶I(CBHI)序列的保守性，發(fā)現(xiàn)CBHI進(jìn)化具有高度的保守性。根據(jù)蛋白保守序列設(shè)計(jì)兼并引物，PCR擴(kuò)增得到約1.0kb片段。測(cè)序結(jié)果顯示該片段與構(gòu)巢曲霉(AspergillusNidulans)cbh

5、l相似性最高(79％)。在此基礎(chǔ)上，采用熱不對(duì)稱嵌套PCR方法首次克隆了適冷產(chǎn)黃青霉FS010的cbhl基因。該基因含有長(zhǎng)1590bp的開放閱讀框，編碼529個(gè)氨基酸，氨基酸序列中含有3個(gè)潛在的N-乙酰糖基化位點(diǎn)。對(duì)氨基酸序列同源性分析表明該蛋白屬于糖苷水解酶第七家族。Southern雜交顯示cbhl基因在基因組中以單拷貝存在。RT-PCR分析了9種碳源對(duì)cbhl基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示纖維二糖和龍膽二糖是強(qiáng)誘導(dǎo)物，乳糖和木糖也能不同程

6、度誘導(dǎo)基因表達(dá)。將cbhl cDNA在釀酒酵母中表達(dá)，重組CBHl分子量為62kDa，酶活性為102.4U/mg，重組酶最適作用溫度為45℃，最適pH值為5.5。 產(chǎn)黃青霉是許多酶制劑和抗生素的工業(yè)生產(chǎn)菌株，研究產(chǎn)黃青霉基因表達(dá)調(diào)控可以為產(chǎn)黃青霉的工業(yè)育種提供必要的理論依據(jù)。采用TAIL-PCR克隆了產(chǎn)黃青霉cbhl基因的1316bp的5’調(diào)控區(qū)。同源性分析表明該調(diào)控區(qū)序列和其它絲狀真菌cbhl啟動(dòng)子沒(méi)有相似性，說(shuō)明是一個(gè)新啟動(dòng)子

7、。分析了該啟動(dòng)子序列中潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)存在CREI、ACEI、ACEII和CCAAT增強(qiáng)因子結(jié)合基序。對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行5’定向缺失。以u(píng)idA為報(bào)告基因，構(gòu)建了全長(zhǎng)及3個(gè)不同長(zhǎng)度缺失啟動(dòng)子表達(dá)載體pcbhl、pcbhldl、pcbhld2和pcbhld3。將4種報(bào)告質(zhì)粒分別與攜帶乙酰胺酶基因的載體p3S2共轉(zhuǎn)化出發(fā)菌株FS010。轉(zhuǎn)化子點(diǎn)雜交結(jié)果顯示4種報(bào)告載體均已整合到產(chǎn)黃青霉染色體中。GUS酶活測(cè)定結(jié)果顯示在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上4種

8、表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子均有GUS活性。其中，全長(zhǎng)啟動(dòng)子GUS活性最高(316.8u/rag)。隨著啟動(dòng)子缺失長(zhǎng)度的增加，GUS活性逐步降低。缺失715bp、915bp和1115bp的啟動(dòng)子GUS活性分別為最高活性的66.7％，49.3％和9.0％，說(shuō)明啟動(dòng)子的-200～1316bp區(qū)域內(nèi)存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子靶位點(diǎn)。 反轉(zhuǎn)錄PCR克隆得到FS010 1162bp低溫木聚糖酶全長(zhǎng)cDNA基因。序列分析結(jié)果表明該序列含有完整的開放閱讀框，

9、編碼38kDa蛋白質(zhì)。蛋白序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)該編碼蛋白屬于糖苷水解酶第10族。將該cDNA在大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，重組木聚糖酶活性為10210u/mg。凝膠掃描分析顯示重組大腸桿菌木聚糖酶產(chǎn)量占總蛋白含量的l6.7％。重組低溫木聚糖酶最適作用溫度為25℃，比常溫木聚糖酶最適作用溫度低15℃。在4℃下，重組低溫木聚糖酶仍具有80％最高酶活力，比同等溫度下常溫產(chǎn)黃青霉木聚糖酶活性高10倍。這種優(yōu)良特性使該低溫木聚糖酶在環(huán)境保護(hù)、食